銀杏葉總黃酮的負壓沸騰提取工藝1)

周昊 王成章 葉建中 陳虹霞 陶冉 張宇思

(中國林業科學研究院林產化學工業研究所，南京，210042)

銀杏(Ginkgo biloba L)又名白果、公孫樹等，為最古老的中生代孑遺植物。銀杏葉中含有豐富的黃酮類化合物，具有改善心腦血管循環、抗過敏、抗病毒、抗癌、抗衰老及降低膽固醇等作用［1-3］。以銀杏葉總黃酮為原料的加工產品已經廣泛應用于醫藥業、化妝品、食品制造業［4-5］。

銀杏葉總黃酮為熱敏性活性物，在光、熱和酶作用下容易分解，產生次生代謝產物［6］。國內銀杏葉提取物生產企業大多采用傳統的熱回流提取，以熱浸式和滲漉式為主，生產工藝存在最突出的問題是:時間長，提取效率低;對于總黃酮產生破壞較多;提取液質量不高，總黃酮含量低，雜質多，造成后續工藝提純復雜，如濃縮、醇沉、水沉、過濾、離心、吸附等，從而造成了生產周期長，能耗和成本大大上升，且資源浪費嚴重［7-8］。負壓提取法通過在常規提取器上引入真空系統，以抽氣的形式激發的微小氣泡(空化核)在瞬間潰滅，使其周圍產生強烈的空化效應和機械效應加速原料組織中有效成分的溶出，從而實現了低溫、快速提取，可以有效防止提取過程中熱不穩定物質的分解，是一種新型的提取方法［9］。負壓沸騰提取與響應曲面設計相結合在銀杏葉中總黃酮的提取中的應用尚未見報道，本實驗采用負壓沸騰技術提取銀杏黃酮等熱敏性成分，從而為銀杏葉的提取探索一條更為有效的工藝途徑。

1 材料與方法

島津LC-20AT 型高效液相色譜儀;島津SPDM20A 型二極管陣列檢測器。銀杏葉(銀杏黃酮質量分數為9．80%)，于2012 年8 月采自邳州銀杏葉生產基地港上鎮，采集后避光自然陰干;槲皮素、山萘素、異鼠李素對照品純度均為98%以上;甲醇為色譜純;其它化學試劑均為分析純。

1．1 HPLC 測定方法

色譜條件:色譜柱C18ODS(4．6 mm×200 mm，5 μm)，流動相:V(甲醇)∶V(水)= 50 ∶50(水中含0．4%的磷酸)，檢測波長360 nm，流速1 mL/min。

標準曲線繪制:分別精密稱取槲皮素、山奈酚、異鼠李素對照品適量，置于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成質量濃度分別為0．854、0．562、0．259 g/L 的混合對照品溶液;依次精密量取混合對照品溶液0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．40 和0．50 mL 置于5 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻后分別取10 μL 進樣，進行色譜分析。

樣品測定:精密稱取銀杏葉干粉經提取、濃縮、干燥后制得的銀杏提取物粉末0．1 g，置于50 mL 圓底燒瓶中，加入30 mL(V(甲醇)∶V(25%鹽酸)=4 ∶1)混合液，搖勻溶解，置于水浴(85 ℃)中加熱回流30 min，然后迅速冷卻至室溫，轉移至50 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻，即得樣品溶液。

1．2 負壓沸騰提取銀杏黃酮的單因素試驗

提取溶劑的選擇:常壓下，分別稱取10．0 g 銀杏葉干粉原料，按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g 加入不同溶劑(水、20%、40%、60%、80%、100%乙醇溶液)，提取時間2 h，提取溫度80 ℃，測定不同提取溶劑對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

不同提取壓力對應的沸騰溫度:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇溶液，分別采用不同的提取壓力-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05和-0．04 MPa，測定不同提取壓力下溶液開始沸騰時的溫度。

提取壓力的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g、提取時間為120 min 條件下負壓提取2 次，考察在不同提取壓力如-0．1、-0．09、-0．08、-0．07、-0．06、-0．05 和-0．04 MPa 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

提取時間的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 的條件下負壓提取2 次，考察在不同提取時間如15、30、45、60、90、120、150 和180 min 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

液料比的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、提取時間為60 min 的條件下負壓提取2 次，考察在不同料液比為4、6、8、10、12、15 和20 mL/g 時對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

提取次數的選擇:分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，60%乙醇為提取溶劑，在提取壓力為-0．08 MPa、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g、提取時間為60 min 的條件下負壓提取，考察在不同提取次數如1、2、3、4、5 對銀杏葉總黃酮提取率的影響。

1．3 負壓沸騰提取銀杏黃酮的響應面優化

根據Box-Behnken 試驗設計原理，在單因素試驗結果基礎上，選取3 個主要試驗因素和3 個水平，對提取工藝進行響應面分析試驗，3 個主要因素為提取壓力、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和提取時間。

1．4 負壓沸騰提取與傳統提取的比較試驗

分別稱取銀杏葉干粉原料10．0 g，負壓沸騰提取工藝在優化的最佳工藝條件下進行;傳統提取工藝是按V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g 加入60%乙醇水溶液，80 ℃下常壓熱回流提取2 h，提取2 次，提取液過濾后合并。

2 結果與分析

2．1 銀杏黃酮的HPLC 測定結果

線性關系考察結果得出槲皮素標準曲線方程為y=28 665x-22 686，r=0．999 6，表明槲皮素在8．54 ～85．4 mg/L 質量濃度內與吸光度有良好的線性關系;山奈素標準曲線方程為y=30 942x+22 770，r=0．999 8，表明山奈素在5．62～56．2 mg/L 質量濃度內與吸光度有良好的線性關系;異鼠李素標準曲線方程為y=36 469x-33 875，r=0．999 6，表明異鼠李素在2．59～25．9 mg/L 質量濃度內與吸光度有良好的線性關系。

由圖1 可知，銀杏葉總黃酮樣品與標準品出峰時間基本一致，經負壓提取得到的銀杏葉總黃酮在上述的色譜條件下，銀杏葉總黃酮的HPLC 峰分離效果較好，其峰在一定范圍內沒有其他峰的干擾。

圖1 銀杏黃酮標準品及樣品的HPLC 圖譜

2．2 單因素試驗

提取溶劑的優選:由表1 可知，隨著乙醇體積分數的升高，總黃酮苷的提取率也隨之升高，當體積分數為60%提取率達到最大為93．38%。但隨著乙醇體積分數的提高，其提取率呈下降趨勢，其原因是銀杏黃酮易溶于含水乙醇，在一定溶液體積范圍內，當乙醇體積分數達到60%以后，銀杏葉總黃酮溶解度最大，乙醇體積分數加大反而溶解度下降，因此，銀杏葉總黃酮的最佳提取溶劑為60%乙醇溶液。

此外，這也可能與銀杏葉的組分以及銀杏葉總黃酮的物理性質有關，銀杏葉總黃酮易溶于乙醇水，銀杏葉總黃酮與植物組織中的蛋白質、生物堿、多糖等物質發生復合，乙醇與水的混合液可打斷銀杏葉總黃酮物質與蛋白質、多糖等物質的結合鍵，有利于銀杏葉總黃酮的提取;但乙醇體積分數過高，會使銀杏葉中細胞失水而造成纖維間緊縮，影響銀杏葉總黃酮的滲出［10］。

不同提取壓力對應的沸騰溫度:由于溶媒的沸點是隨外界大氣壓的降低而降低的，所以在負壓的條件下，就可以在較低的溫度下使溶液處于沸騰狀態下而進行提取，這樣既不致于使植物中熱敏性物質遭受高溫煎煮的破壞，又不會由于高溫煎煮導致大量容易水解產生大分子雜質如淀粉、糊精、蛋白質、色素、鞣酸、粘液質等［11］。

試驗測得壓力為-0．1 MPa 時對應的沸騰溫度為41～44 ℃;-0．09 MPa 時對應的沸騰溫度為46～51 ℃;-0．08 MPa 時對應的沸騰溫度為50 ～55 ℃;-0．07 MPa 時對應的沸騰溫度為60 ～65 ℃;-0．06 MPa 時對應的沸騰溫度為70 ～75 ℃;-0．05 MPa 時對應的沸騰溫度為80～85 ℃;-0．04 MPa 時對應的沸騰溫度為86～90 ℃。

提取壓力的影響:由表1 可知，隨著提取負壓的升高，銀杏葉總黃酮的提取率先升高后降低，當提取壓力在-0．08 MPa 時，提取率達到最大。其原因可能是提取負壓的上升，使得提取溫度降低，銀杏葉總黃酮在溶液中擴散速度變慢，提取率會有所降低。故提取壓力優選為-0．08 MPa。

提取時間的影響:由表1 可知，隨著提取時間的增加，銀杏葉總黃酮的提取率呈上升趨勢，60 min 時達到最大值;隨著時間的延長提取率會略有下降，這表明銀杏葉總黃酮的溶出量與時間密切相關，提取時間過短可能使提取不夠充分，但提取時間過長又可能引起銀杏葉總黃酮結構的變化進而使其含量降低。

料液比對提取率的影響:由表1 可知，隨著乙醇溶液體積量的增加，銀杏葉總黃酮的提取率呈現上升趨勢，在V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g的條件下銀杏葉總黃酮的提取率達到93．26%，繼續增加料液比其提取率變化不大;其原因可能是隨著料液量增加，銀杏葉總黃酮溶解量增加，使其提取率升高;但是銀杏葉總黃酮在水的體積量較大的情況下容易水解，并且隨著溶液總體積量增大，水的體積量也相應的增加最終使銀杏葉總黃酮水解程度加劇，從而影響銀杏葉總黃酮提取率。因此，最優選擇為V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g。

提取次數的影響:銀杏葉總黃酮在負壓提取的條件下，提取1 次，提取率為73．34%，提取2 次，提取率達到96．79%。2 次提取幾乎把銀杏葉總黃酮提取完全。因此在負壓提取條件下，從生產成本及可操作性等方面綜合考慮選擇2 次提取較為合適。

表1 銀杏葉總黃酮負壓提取工藝的單因素試驗結果

2．3 響應面分析法優化

2．3．1 回歸模型的建立和顯著性檢驗

利用Design-expert7．1．6，采用Box-Behnken 模型以銀杏總黃酮提取率為指標，選取提取壓力(A)、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)(B)、提取時間(C)設計3 因素3 水平共17 個試驗，其中包括13 個析因試驗和4 個檢驗誤差的零點試驗，試驗結果見表2，方差分析見表3。

通過對表2 數據進行回歸分析，得到二次多項回歸方程為:Y=92．93+2．22A+0．18B+1．55C-1．13AB-1．14AC+1．57BC-3．56A2-2．93B2-1．57C2。從表3 可以看出，模型的F＜0．000 1，表明該模型非常顯著;信噪比=16．697，說明該模型可用于預測;修正可決系數=94．92%，表明總變異中僅有5．08%不能用該模型解釋;可決系數=97．78%，表明銀杏葉總黃酮提取率的預測值與實際值之間具有較好的擬合度。失擬項的F 值為0．053，系統顯示為不顯著。也說明使用該方程進行擬合的效果較好，因此該模型可用于分析、預測銀杏葉總黃酮的實際提取率。

表2 銀杏葉總黃酮負壓提取工藝的響應面分析試驗結果

另外從表3 還可以看出，一次項中A 和C 的回歸系數極顯著，說明提取壓力和時間對銀杏葉總黃酮提取率有極顯著影響;而B 的回歸系數不顯著，即V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)對響應值沒有顯著影響。交互項AB 和AC 的偏回歸系數顯著，即提取壓力和V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)、提取壓力和時間的交互項對銀杏葉總黃酮提取率有顯著影響。交互項BC 的偏回歸系數極顯著，說明V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和時間的交互項對銀杏葉總黃酮提取率有極顯著影響;二次項中A2、B2、C2的偏回歸系數達到極顯著水平。

表3 回歸模型方差分析

2．3．2 響應曲面分析

根據回歸方程，做出響應面和等高線，考察擬合響應面的形狀，分析提取壓力、V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)和提取時間對銀杏葉總黃酮提取率的影響，如圖2 所示。等高線的形狀可反應交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。從圖3 中可以看出，各因素間的交互作用顯著。響應曲面可較為直觀地看出各因素對銀杏葉總黃酮提取率的影響，曲線越陡峭，表明該因素對提取率的影響越大，由圖2 可以看出，提取壓力和提取時間對銀杏葉總黃酮提取率的影響最顯著，表現為在各圖中曲面較陡，而V(60%乙醇):m(銀杏葉干粉)的影響不顯著，表現為曲線較平滑，這也符合表3 的方差分析結果。

圖2 各因素之間的響應曲面及等高線圖

2．3．3 最佳提取工藝的確定及模型的驗證

由分析軟件可直接得出最優提取工藝為:提取壓力-0．082 18 MPa，提取時間74．13 min，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 11．16 mL ∶1 g，所得銀杏葉總黃酮提取率為93．55%，但從試驗的可行性考慮，將最優工藝調整為:提取壓力-0．08 MPa，提取時間70 min，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)=10 mL ∶1 g。為了驗證響應面法所得結果的準確性，并結合實際提取銀杏黃酮，重復試驗3 次，所得的銀杏葉總黃酮提取率分別為93．06，93．48 和93．72，平均值為93．42%，二者的誤差小于0．5%。說明由響應面法所得的銀杏葉總黃酮提取條件與實際試驗結果相近，有很好的參考作用。

2．4 銀杏黃酮的負壓沸騰提取與傳統提取工藝的比較

以銀杏葉總黃酮提取率和干膏的得率為考察因素，對銀杏葉總黃酮的負壓沸騰提取工藝與傳統的常壓回流提取工藝進行了比較，結果見表4，結果表明負壓沸騰提取法的提取率要高于傳統的常壓回流提取法，且負壓沸騰提取工藝所得的干膏質量小，雜質含量減少，負壓提取時間也較短，較常壓提取時間減少了42%，大大降低生產成本。

表4 負壓與常壓回流提取法比較

3 結論與討論

在單因素試驗的基礎上，采用RSA 優化了銀杏黃酮的負壓沸騰提取工藝參數，建立了回歸模型方程，該模型回歸極顯著，說明該方程對試驗擬合較好。通過響應面分析得到優化的提取工藝條件是:以60%乙醇溶液為提取溶劑，提取壓力-0．08 MPa，提取時間70 min，提取溫度50 ℃，V(60%乙醇)∶m(銀杏葉干粉)= 10 mL ∶1 g，提取2 次。該條件下銀杏葉總黃酮提取率的預測值為93．55%，驗證值為93．42%，兩者十分接近，說明響應值的試驗值與回歸方程預測值吻合良好，優化結果可信，具有實用價值。

與傳統的高溫熱回流提取方法相比，采用負壓沸騰法提取銀杏葉中總黃酮，不僅提取溫度低為50 ℃，保證銀杏黃酮等熱敏性成分不被破壞，且提取時間大大縮短了42%，提取率大大提高了13%，提取液中黃酮含量提高了65．90%，明顯好于傳統方法，優勢明顯。因此該方法可為工業化提取銀杏黃酮提供借鑒。

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