響應面優化提取桔梗多糖及其抗癌活性研究

陸文總，高 帆，郭 銳，趙 晨，賈光鋒

（西安工業大學 電子信息工程學院，西安710021）

近年來，由于化學合成藥物的毒副作用使其已 不能獲得理想的治療效果，人們越來越傾向于尋找綠色的天然中草藥.因此，發揮我國藥用植物資源豐富的優勢，從中草藥中尋找抗腫瘤新藥是開發新藥的一條重要途徑.桔梗為多年生草本植物，藥用其根，其富含桔梗皂甙、多糖、萜類、桔梗酸等成分.近代藥理和臨床醫學研究表明，它具有鎮咳、抗炎、抗氧化、抗腫瘤、提高人體免疫力等廣泛的藥理活性［1－4］.在中草藥溶劑萃取法的發展中，各種參數在優化實驗條件中發揮重要的作用.有學者對桔梗多糖的優化提取采用了正交試驗［5］，但是響應面法獲得的結果更直觀，且可以反應各因素間的交互作用［6－7］.目前國內外學者對桔梗的研究主要集中在脂溶性的皂苷類物質，而水溶性多糖物質因其結構復雜且不易純化，對多糖的提取及生物活性研究較少.提取時間、提取溫度、提取的重復數和固體－液體比通常被認為是影響中草藥多糖產率的最重要因素，本研究以多糖提取率為響應值，采用中心組合設計的方法，研究各自變量及其交互作用對桔梗多糖提取率的影響，并利用比色法評價其對HeLa癌細胞生長的影響.

1 材料與方法

1.1 試驗材料

二氧化碳培養箱、多功能酶標儀（MK-3）、旋轉蒸發儀、HeLa細胞株、96－孔板、RPMI－1640 細胞培養基、胎牛血清，［3-（4，5－二甲基噻唑－2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽］（MTT）、胰蛋白酶和二甲基亞砜（DMSO），其它化學試劑均為分析純.桔梗購于西安市萬壽路中藥材批發市場，經專家鑒定為正品.

1.2 多糖提取工藝

為了確定料液比對多糖產率的影響，風干的12g，6g，4g，3g，2.4g桔梗樣品分別加入120 mL的蒸餾水，獲得料液比為1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50，1∶60g·mL－1預處理樣.在室溫（28±2）℃高溫（90±2）℃下分別提取24h，60 min，攪拌速度為300rpm，收集冷、熱水提物.

為了確定提取溫度和時間對多糖產率的影響，試驗設計5種不同提取溫度（50，60，70，80，90）℃，料液比為1∶30，提取時間為0～6h.使用多級交錯提取法確定提取次數對多糖產率的影響.在第一階段，熱水加入原料（料液比為1∶30）混合，通過離心獲得殘留物，每次的殘留物經過熱水重新提取，直至5次.5 000rpm離心10min后，收集含多糖的上清液，濃縮.濃縮液中加入95%的乙醇析出桔梗多糖，4 000rpm離心5min后，收集多糖.

1.3 提取條件優化

在單因素實驗基礎上，確定主要影響桔梗多糖產率的三個因素為料液比、提取溫度、時間.根據Box－Behnken Design中心組合試驗設計原理，結合單因素試驗結果，采用3因素3水平的響應面法優化多糖提取參數，試驗因素與水平設計見表1～2.

表1 響應面分析因素與水平Tab.1 Variables and levels of response surface design

1.4 總糖含量測定

采用硫酸苯酚法測定桔梗粗多糖提取物的總糖含量［8］.粗多糖提取率（%干重）＝（粗多糖／樣品干重）×100%.

1.5 多糖對HeLa細胞生長的影響

采用傳統的MTT法檢測桔梗多糖對人宮頸癌HeLa細胞生長的影響.將HeLa細胞接種在含10%胎牛血清、100U／ml青霉素、100μg·mL－1鏈霉素的RPMI－1640培養基的培養皿內，在37℃和5%CO2培養箱培養，當細胞鋪滿培養瓶的80%～90%時，以0.25%胰酶消化進行傳代.調整對數生長期細胞密度至3×105mL，接種于96孔細胞培養板，每孔150μl，在37℃、5%CO2培養箱中培養24h使細胞完全貼壁.加入桔梗多糖處理，使其終濃度為 10，20，40，60，80，100μg·mL－1，培養箱中培養48h.每孔加入10mg·mL－1MTT 10μL，繼續培養4h，棄去培養液，加入150μL DMSO，置于酶標儀上492nm處測定光密度值（Optical Density，OD）.

細胞生長抑制率＝（1－處理組平均OD值／對照組平均OD值）×100%

1.6 數據統計

表2 響應面分析方案及試驗結果（n＝3）Tab.2 Experimental results and response surface design（n＝3）

2 結 果

2.1 料液比對多糖提取率影響

在不同的料液比條件下，室溫下桔梗粗多糖提取率不超過1.5%；在90℃下，粗多糖提取率為2.5%～6.2%如圖1所示.料液比為1∶10，90℃，30min時發現有凝膠化現象，因此1∶10的料液比在90℃下不能用于提取多糖.料液比為1∶30時，粗多糖提取率約為6%，隨著水體積的增加多糖提取率增高不顯著.

圖1 料液比對多糖產率的影響Fig.1 Effect of solid-to-liquid ratio on polysaccharide yield

2.2 提取溫度和時間對多糖提取率影響

固定料液比為1∶30g·mL－1條件下，研究溫度和時間對粗多糖提取率的影響.隨著提取溫度的升高，粗多糖提取率不斷上升如圖2所示.實驗結果表明，在（50，60，70，80）℃下提取120min粗多糖提取率達到飽和水平，分別為4.2%，4.3%，于4.5%，4.7%；而在90℃下提取90min，粗多糖提取率已達到飽和水平5.8%.且粗多糖提取率要達到5%，80℃下需提取180min，90℃下只需50min.

圖2 提取溫度和時間對多糖產率的影響Fig.2 Effect of the extraction temperature and time on polysaccharide yield

2.3 提取次數對多糖提取率影響

固定料液比為1∶30g·mL－1、90℃條件下，第一次提取60min，120min，桔梗粗多糖提取率分別為5.3%和5.6%.第二次提取后粗多糖的提取率小于0.5%，而第三次提取時，粗多糖產率接近0.1%如圖3所示.

2.4 優化多糖提取條件

應用Design Expert軟件對試驗數據進行回歸分析，結果見表3.

圖3 提取次數對多糖產率的影響Fig.3 Effect of the number of the extraction on polysaccharide yield

表3 響應面二次模型方差分析表Tab.3 ANOVA for response surface quadratic model

對各因素回歸擬合得到回歸方程：提取率＝4.63＋0.24 X1＋0.80 X2＋0.73 X3＋0.14 X1X2＋0.005 X1X3－0.29 X2X3－0.29 X12＋0.41 X22－0.33 X23.該模型統計結果見表3，回歸方程中因變量和全體自變量之間的線性關系顯著（r＝11.71／12.17＝0.96，P＜0.01），所以該試驗方法是科學的.對響應值作用顯著的是 X2、X3、X22（P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05），對提取率影響大小依次是提取溫度、時間和料液比，即提取溫度對桔梗粗多糖提取率的影響最顯著.

圖4 提取因素對多糖產率的響應面及等高線Fig.4 Response surface and contour plot of different extraction factors on the yield of polysaccharide

模型的響應面及其等高線如圖4所示，等高線圖的形狀可以反映出交互效應的強弱，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形則相反.試驗結果表明，等高線沿著自變量的軸走向密度較小、曲線不陡，表明提取時間、溫度和料液比之間的兩兩交互作用不顯著，與統計結果相符.

應用Design Expert軟件進行提取工藝優化條件：提取時間81.6min、溫度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率為6.1%.為了檢驗試驗結果的真實性，根據以上結果進行近似驗證試驗，選擇提取時間80min、溫度90℃、料液比1∶35進行3次重復試驗，其結果提取率平均值為6%，實測值與預測值很接近，說明該模型是科學有效的.

2.5 粗多糖中總糖含量

經過硫酸苯酚法測定，桔梗粗多糖提取物的總糖含量為35.2%.

2.6 抗HeLa細胞生長活性

為了初步鑒定桔梗多糖是否具有抗癌活性，利用MTT法來研究桔梗多糖對HeLa細胞的生長抑制作用.試驗結果如圖5所示，桔梗多糖處理HeLa細胞48h后的抑制率與作用劑量的回歸方程為y＝0.7885x＋10.358（R2＝0.9615），半數抑制濃度IC50為50.28μg·mL－1.并且，多糖濃度為80、100μg·mL－1時對HeLa細胞的抑制作用差異不顯著，我們推測桔梗多糖體外具有抑制HeLa細胞生長的作用.

圖5 MTT法測定多糖HeLa細胞生長的抑制作用Fig.5 The cytotoxic effect of polysacharide on HeLa cells by MTT assay

3 討 論

3.1 料液比對桔梗多糖提取工藝的影響

在多糖提取過程中，料液比增大，可增加藥材與溶劑的接觸面積，使多糖分子容易從樣料表面擴散出來.而且，提高水的體積能增加多糖從藥材顆粒中解析量以及增加水溶劑進入細胞的擴散系數.但是料液比越大，消耗的動力也越大，在動力因素一定的條件下，溶劑過多，多糖溶出率反而更低，因此從經濟上和多糖提取率綜合考慮，確定最佳料液比為1∶30.

3.2 提取溫度和時間對桔梗多糖提取工藝的影響

提高溫度能使水溶液粘性較小和傳質阻力最小化，因此在高溫比低溫時多糖的提取率較高.在一些報道中，植物多糖提取溫度約為90℃，溫度過高會容易影響多糖物質的活性特性，甚至使多糖物質的活性喪失.在90℃下，提取90min桔梗多糖產率已接近飽和水平.而且，提取時間越長，溶出的雜質也會越多.因此為了避免消耗更多的時間和減少后續處理工作量，確定最佳提取溫度為90℃，提取90min.

3.3 提取次數對桔梗多糖提取工藝的影響

第二次提取中多糖得率比第一次明顯減少，且提取次數越多，消耗的動力能源和時間越多，濃縮成本也越高，因此從實際生產成本考慮，提取1次是水提多糖的最適次數.

3.4 桔梗多糖提取工藝的優化

響應曲面法采用多元二次回歸方法，通過研究因素與因素間的交互作用，對擬合后的回歸方程進行分析，篩選最佳提取條件，同時能直觀地分析各因素的相互影響，試驗周期短，精密度高［9］.試驗分析得出的最佳提取條件，通過驗證試驗發現其結果與預測值相近，說明在桔梗多糖提取的實際生產中可以使用此最優工藝.

3.5 粗多糖中總糖含量

多糖是極性大分子化合物，通常破碎后的原料常用水做溶劑來提取粗多糖.因為大部分活性多糖在有機溶劑中的溶解度極低，所以獲得粗多糖提取液后，常用乙醇來沉淀粗多糖.經乙醇沉淀獲得的粗多糖中，還含有大分子蛋白質、脂類、有機溶劑不溶的一些低分子質量有機物及無機物.粗多糖是復合型雜多糖，主要有黏多糖、脂多糖、結合多糖（糖蛋白及黏蛋白）、可溶性寡糖、單糖等，各種中草藥粗多糖的總糖含量也不相同.

3.6 桔梗多糖對HeLa細胞生長的影響

中藥多糖具有調節免疫功能、抗輻射和抗腫瘤等多種生物學活性.特別是多糖的抗腫瘤作用具有毒副作用小，能提高機體的免疫功能并抑制腫瘤生長，與化療藥物適當組合，可降低或免除化療藥物帶來的免疫抑制以及其他毒副作用等特點，為惡性腫瘤的治療開辟了新的方向［10］.試驗結果表明，桔梗粗多糖對HeLa癌細胞具有較好的抑制其生長的作用，為其后期的研究奠定了基礎.粗多糖成分復雜，很可能含有多種活性糖類分子，不同的活性糖類分子對HeLa細胞生長的影響也各不相同.在后期的試驗中需要篩選確定出抑制HeLa細胞生長的活性多糖分子，進一步進行其構效關系的研究.

4 結 論

通過響應面法優化了水提醇沉法提取桔梗粗多糖，其最佳提取參數：提取時間81.6min、溫度90℃、料液比1∶36.7g·mL－1，多糖提取率為6.1%.桔梗粗多糖顯著地抑制HeLa細胞的生長，該研究結果對桔梗多糖在生物、醫學領域的深入開發具有一定的參考價值.

［1］ ZHANG L，WANG Y L，YANG D W，et al.Platycodon Grandiflorus -an Ethnopharmacological，Phytochemical and Pharmacological review ［J］.J Ethnopharmacol，2015，164：147.

［2］ PARK S，YOO J，KIM H，et al.The Physiochemical Characteristics and Anti-Oxidant Activity of Extracts of Platycodon Grandiflorus（Jacquin）A.De Candolle［J］.Planta Med，2013，79（13）：1267.

［3］ JANG K J，KIM H K，HAN M H，et al.Anti-Inflammatory Effects of Saponins Derived from the Roots of Platycodon Grandiflorus in Lipopolysaccharide-Stimulated BV2Microglial Cells［J］.Int J Mol Med，2013，31（6）：1357.

［4］ CHOI J H，WANG Y P，KIM H G，et al.Saponins from the Roots of Platycodon Grandiflorum Suppresses TGFβ1-Induced Epithelial-Mesenchymal Transition Via Repression of PI3K／Akt，ERK1／2and Smad2／3PathWay in Human Lung Carcinoma A549 Cells［J］.Nutr Cancer.2014，66（1）：140.

［5］ 張超云，郝鵬飛，黃顯章.基于正交試驗優化微波技術提取桐桔梗多糖工藝［J］.世界科學技術－中醫藥現代化，2013，15（7）：1644.ZHANG Chao-yun；HAO Peng-fei；HUANG Xianzhang.Optimization on Microwave Extraction Crafts for Polysaccharide from Radix Platycodonis Based on Orthogonal Test ［J］.Modernization of Traditional Chinese Medicine and Materia Medica-World Science and Technology，2013，15（7）：1644.（in Chinese）

［6］ 汪偉，莫蓉，范慶明.基于響應面模型的跨音速轉子葉片氣動優化設計研究［J］.西安工業大學學報，2013，33（2）：114.WANG Wei，MO Rong，FAN Qing-ming.Aerodynamic Optimization Design of the Transonic Rotor Blade Based on the Response Surface Model［J］.Journal of Xi’an Technological University，2013，33（2）：114.（in Chinese）

［7］ 王永菲，王成國.響應面法的理論與應用［J］.中央民族大學學報：自然科學版，2005，14（3）：236.WANG Yong-fei，WANG Cheng－guo.The Application of Response Surface Methodology［J］.Journal of the CUN：Natural Sciences Edition，2005，14（3）：236.（in Chinese）

［8］ 趙瑩，劉飛，于之倫.苯酚－硫酸法測定柳芽中多糖含量的研究［J］.中國西部科技，2014，13（12）：64.ZHAO Ying，LIU Fei，YU Zhi-lun.Application of Phenol-Sulfuric Acid Method in Determination of Polysaccharides in Willow Sprouts［J］.Science and Technology of West China，2014，13（12）：64.（in Chinese）

［9］ 張力力，黃靜，張琦.響應曲面法優化蛇床子中蛇床子素的提取工藝［J］.黑龍江畜牧獸醫，2014，（9）：45.ZHANG Li-li，HUANG Jing，ZHANG Qi.Optimization of the Extraction Process for Osthole from Fructus Cnidii Using Response Surface Methodology［J］.Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，2014，（9）：45.（in Chinese）

［10］ GOODAZRZI N，VARSHOCHIAN R，KAMALINIA G，et al.A Review of Polysaccharide Cytotoxic Drug Conjugates for Cancer Therapy［J］.Carbohydrate Polymers，2013，92（2）：1280.