18F-FES小動物PET/CT評價不同乳腺癌模型雌激素受體表達的差異

何思敏，羅健民，張建平，章英劍

1.復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；2.上海市質子重離子醫院核醫學科，上海 201321；3.復旦大學生物醫學影像研究中心，上海 200032；4.上海分子影像探針工程技術研究中心（籌），上海 200032

18F-FES小動物PET/CT評價不同乳腺癌模型雌激素受體表達的差異

何思敏1，2，3，4，羅健民1，2，3，4，張建平1，2，3，4，章英劍1，2，3，4

1.復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海 200032；2.上海市質子重離子醫院核醫學科，上海 201321；3.復旦大學生物醫學影像研究中心，上海 200032；4.上海分子影像探針工程技術研究中心（籌），上海 200032

目的：用16α-18F-17β-雌二醇（18F-FES）小動物PET/CT評價不同類型乳腺癌模型雌激素受體（ER）表達的差異。方法：用ER陽性人乳腺癌細胞（ZR-75-1、MCF-7）和陰性細胞（MDA-MB-231）構建荷瘤裸鼠動物模型。陽性組每組各10只，接種前3 d植入雌激素緩釋片，再將細胞與基質膠混合液接種于乳腺脂肪墊，成瘤后顯像前3 d取出緩釋片。陰性組5只，直接將細胞懸液接種于乳腺脂肪墊。當腫瘤長至長徑5 mm左右時行18F-FES PET/CT顯像，用%ID/gmax定量ER表達，然后用免疫組化測定并比較ER結果。數據分析采用單因素方差分析。結果：ZR-75-1、MCF-7和MDA-MB-231的瘤體成瘤率分別為100%（10/10）、70%（7/10）和100%（5/5），瘤體隨時間延長而增大，但三組之間差異無統計學意義（P＞0.05），18F-FES %ID/gmax分別為6.6±1.0、3.3±0.5和1.1±0.1，三組之間差異均有統計學意義（P＜0.05）。T/M比值分別為4.2±0.3、2.6±0.2和1.1±0.1，三組之間差異均有顯著統計學意義（P＜0.001）。18F-FES顯像結果與免疫組化結果呈正相關（%ID/gmax：r2=0.65，P＜0.001；T/M：r2=0.87，P＜0.001）。結論：18F-FES PET/CT的%ID/gmax能準確評價不同類型荷人乳腺癌模型的ER表達水平，從而為進一步研究乳腺癌內分泌療效提供了一種活體、無創、動態的分析方法。

乳腺癌模型；雌激素受體；18F-FES；PET/CT ；MCF-7；ZR-75-1 ；MDA-MB-231

75%乳腺癌為雌激素受體（estrogen receptor，ER）陽性［1］，需通過免疫組化離體檢測ER表達水平，從而制訂治療方案和評估預后。但腫瘤異質性及耐藥等因素導致療效不理想［2］，因此探討耐藥機制、篩選有效的耐藥逆轉方法和設計個體化治療方案已成為臨床治療乳腺癌的熱點問題，而對這些問題的研究均有賴于準確檢測ER的方法和建立合適的實驗動物模型。本研究旨在探討16α-18F-17β-雌二醇（18F-fluoroestradiol，18F-FES）PET/CT評價不同類型乳腺癌模型中ER表達水平的可行性，為ER陽性乳腺癌患者設計治療方案和療效監測提供可靠方法。

1 資料和方法

1.1 細胞和動物

ER陽性人乳腺癌細胞（ZR-75-1、MCF-7）和陰性細胞（MDA-MB-231）均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。6周齡BALB/c雌性裸鼠25只，體重20～25 g，購于復旦大學上海醫學院實驗動物部，用于ZR-75-1、MCF-7 （各10只）及MDA-MB-231 （5只）研究，顯像前在實驗中心飼養。

1.2 試劑和儀器

DMEM培養基購自HyClone公司，內含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL；RPMI 1640培養基購自Gibco公司，內含10%胎牛血清、青霉素100 IU/mL、鏈霉素100 μg/mL；0.72 mg/片雌二醇90 d緩釋片購自Innovative Research of America公司；基質膠購自美國BD公司。18F-FES的合成和所需儀器詳見參考文獻［3］。

1.3 細胞培養及動物模型的建立

細胞培養主要參考美國標準生物品收藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）提供的方法。ZR-75-1細胞用RPMI 1640培養基，MCF-7和MDA-MB-231細胞用DMEM培養基，在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中常規培養，每3～4 d于細胞對數生長期時按1∶3傳代培養。陽性組：接種前3 d在裸鼠頸部皮下埋植雌二醇緩釋片，然后將處于對數生長期的ZR-75-1和MCF-7細胞經胰酶消化，以無血清RPMI 1640培養液洗滌，調整活細胞密度為5×106個細胞（約0.1 mL），取0.1 mL細胞懸液與基質膠按2∶1 混勻后，分別接種于裸鼠右側第二乳房墊內。陰性組：調整活細胞密度為1×106個細胞（約0.1 mL），取0.1 mL細胞懸液直接接種于相同部位。腫瘤長至5 mm，于顯像前3 d取出雌二醇緩釋片。有創傷的操作均在無菌麻醉下進行。小鼠飼養于標準動物房。接種后，每3 d用游標卡尺測量腫瘤長徑（a）和短徑（b）。腫瘤體積（tumor volume，TV）的計算公式為：TV=a×（b2）/2［5］，計算每組裸鼠移植瘤體積平均值和標準方差，繪制腫瘤生長曲線。

1.4 荷瘤裸鼠小動物PET/CT顯像

所有荷瘤鼠均尾靜脈注射18F-FES 7.4 MBq，1 h 后在異氟烷麻醉狀態下行小動物PET/CT顯像，三維模式采集20 min靜態圖像。OSEM3D/ MAP法重建，獲得衰減校正后的PET/CT融合圖像，在腫瘤部位和對側肌肉勾畫感興趣區（region of interest，ROI），測量ROI放射性占注入量的百分比（%ID/g），并計算腫瘤與對側肌肉組織比值（ratio of tumor to muscle，T/M）。

1.5 病理檢測

荷瘤裸鼠腫瘤組織經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋，切片厚5 μm，行蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色；二甲苯脫蠟，梯度乙醇至水化后高壓鍋熱處理5～8 min；過氧化物酶阻斷血清封閉，加一抗孵育，4 ℃過夜，接著加二抗及過氧化物酶標記的鏈霉菌抗生物素蛋白。其余步驟按SP試劑盒操作步驟進行，二氨基聯苯胺（3，3'-diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木精復染。免疫組化染色用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）代替一抗為陰性對照，以試劑商提供的陽性片為陽性對照。對ER的判斷標準采用Allred score方法，根據染色陽性細胞的比例和染色強度，陽性細胞比例＜1%為（-）；1%≤陽性細胞比例＜10%為（+）；10%≤陽性細胞比例＜50%為（++）；陽性細胞比例≥50%為（+++）。染色強度分為弱、中、強。若染色強度弱，則陽性級別下降1級。

1.6 統計學處理

2 結 果

2.1 腫瘤生長情況

接種后第7天，接種部位長出結節，周邊泛紅，質地較硬，隨著時間推移腫塊逐漸增大。腫瘤生長曲線見圖1。相比而言，ZR-75-1組的腫瘤平均體積略大于MCF-7荷瘤鼠，但差異無統計學意義（P＞0.05）。ZR-75-1、MCF-7和MDA-MB-231的成瘤率分別是100% （10/10）、70% （7/10）和100% （5/5）。

2.2 荷瘤裸鼠PET/CT顯像

荷瘤裸鼠的PET/CT顯像見圖2。ZR-75-1、MCF-7、MDA-MB-231組18F-FES %ID/gmax分別為6.6±1.0、3.3±0.5和1.1±0.1，ZR-75-1與MCF-7 （P＜0.05）和MDA-MB-231 （P＜0.00 1）比較差異有統計學意義，MCF-7與MDA-MB-231比較差異有統計學意義（P＜0.05）。T/M比值分別為4.2±0.3、2.6±0.2和1.1±0.1，ZR-75-1與MCF-7和MDAMB-231比較差異有統計學意義（P＜0.00 1），MCF-7與MDA-MB-231比較差異有統計學意義（P＜0.00 1）。

圖1 乳腺癌荷瘤裸鼠腫瘤生長曲線

圖2 荷瘤鼠18F-FES PET/CT顯像

2.3 病理檢測

ZR-75-1和MCF-7腫瘤組織經免疫組化證實為ER陽性表達，MDA-MB-231為ER陰性表達（圖3），與PET/CT顯像結果一致。兩者呈正相關（%ID/gmax：γ2=0.65，P＜0.00；T/M：γ2=0.87，P＜0.00 1）。

圖3 腫瘤組織ER免疫組化與18F-FES相關性分析

3 討 論

ER是乳腺癌分型和預后評估的重要指標［6］。目前，主要采用原發灶術后或活檢標本經免疫組化檢測，反映所取病灶部位ER的免疫活性。但由于腫瘤異質性，還不能完全代表全身其他病灶ER的表達狀態。雌激素衍生物最早于1984年由Kiesewetter等［7］用18F標記成功。在過去20余年內，不斷有新的衍生物合成，但迄今為止，18F-FES仍被認為是最佳的正電子藥物［8］，能與ER特異性結合，反映原發灶和轉移灶中有功能的ER（即ER的生物學活性）；同時，可對受體水平進行半定量分析［9］。18F-FES用于診斷人乳腺癌病灶ER狀態已有研究，ER陽性診斷靈敏度為93.33%，特異度為100%［10］，但能否識別不同類型ER陽性人乳腺癌尚不清楚。ZR-75-1和MCF-7均來源于人乳腺癌細胞株，腫瘤形態與親代腫瘤一致，具有乳腺癌細胞的超微結構特征和人類染色體核型，表達ER，且對甾體類激素敏感，廣泛用于臨床前研究［11］。Aliaga等［12］建立ER陽性（MCF-7和T-47D）和ER陰性（MDA-MB-231）人乳腺癌模型，18F-FES %ID/g分別為0.26、0.25和0.24，提示ER陽性乳腺癌模型與ER陰性模型的18F-FES攝取無差異，可能與ER陽性模型未能保持其生物學特性有關。本課題組以前進行MCF-7荷瘤鼠18F-FES顯像，其腫瘤組織最大標準攝取值（maximal standardized uptake value，SUVmax）為0.18～0.30，僅略高于陰性模型MDA-MB-231的0.13～0.16［13］。因此，本研究探討18F-FES識別不同類型ER陽性乳腺癌的可行性，為內分泌療效監測和設計治療方案提供了準確方法。

本研究中，為建立保持ER陽性生物學特性的荷瘤裸鼠，應注意以下幾點。①接種部位：原位接種有利于保持腫瘤的生物學特性。Paget分析了735例乳腺癌尸檢病例后，認為某些腫瘤細胞（種子）對某些器官（土壤）的微環境具有特殊的生長傾向，從而提出了“種子與土壤學說”，也得到其他實驗數據支持［14］。相反，異位移植雖能維持原有腫瘤的組織結構和生理、生化特性，但由于微環境不同，少見或未見轉移。而且，異位移植腫瘤達到一定大小后，瘤體血供差，內部較易出現壞死，不利于后續治療和影像學研究。沈國棟等［15］對裸鼠肋部皮下、腋窩及乳房墊3個接種部位進行比較，發現乳腺癌細胞接種于乳房墊內效果最好，具有成瘤早、生長快且形狀均勻等優點，這可能與乳房墊具有天然囊狀結構及微血管豐富等特點有關。另外，乳腺脂肪墊移植能更好地模擬人類乳腺的組織學、血液供應和對治療的反應。本研究采用乳房墊內原位接種方式建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型，在第21天時腫瘤體積分別達（279±21） mm3、（221±21） mm3和（298±31） mm3。Aliaga等［12］建立MCF-7和T-47D乳腺癌裸鼠模型，細胞株接種后70 d，腫瘤體積僅150 mm3。Paquette等［16］采用MC7-L1和MC4-L2這兩株鼠源性ER陽性細胞建立模型，21 d后腫瘤體積僅分別為（22.1±4.8） mm3和（23.9±6.8） mm3。甄林林等［17］用MCF-7細胞接種于裸鼠建立乳腺癌模型，第30～70天，腫瘤平均長徑為（10±2） mm，當長徑≥10 mm時，腫瘤侵犯皮膚，出現潰瘍性壞死。與上述數據比較，本研究的建模方法能在短時間內獲得恰當的腫瘤模型，滿足臨床前研究。②將癌細胞與基質膠混合后接種，可通過兩種機制提高成瘤率和促進轉移：一方面，形成一個屏障，使癌細胞免受巨噬細胞、自然殺傷細胞（natural killer，NK細胞）和淋巴因子激活的殺傷細胞（lymphokineactivated killer cell，LAK）前體細胞的作用；另一方面，基質膠提供一個自然的結構或立體空間，使瘤細胞接近一些黏附分子或促有絲分裂因子，如層粘連蛋白、纖連蛋白和Ⅳ型膠原纖維［18］。③激素水平：Eietreby等［19］認為，動物體內雌激素水平太低，不能支持腫瘤的生長，需要補充外源性雌激素促進腫瘤生長，否則即使在未切除卵巢的雌鼠內也無腫瘤生長。劉建中等［20］發現，MCF-7不加雌激素腫瘤移植成功率僅33.3%（10/30）。因此，建立ER陽性模型期間，裸鼠體內需補充一定量的雌激素。本研究采用Van Slooten等［4］的方法，在裸鼠頸部皮下埋植0.72 mg雌二醇90 d緩釋片，發現接種后21 d，荷瘤鼠腫瘤體積達200 mm3以上，因此選擇30 d的緩釋劑更經濟。

本研究構建了ZR-75-1和MCF-7兩種ER陽性原位乳腺癌模型，另建立MDA-MB-231陰性模型為對照。由18F-FES PET/CT顯像可見，ER陽性腫瘤均明顯攝取，陰性不攝取。18F-FES % ID/gmax分別為6.6±1.0、3.3±0.5和1.1±0.1。T/M比值分別為4.2±0.3、2.6±0.2和1.1±0.1。免疫組化結果顯示，ZR-75-1和MCF-7腫瘤組織ER陽性表達，MDA-MB-231為ER陰性表達。為進一步驗證18F-FES檢測不同乳腺癌模型ER表達的能力，對PET/CT顯像結果和免疫組化結果進行相關性分析，兩者呈正相關（%ID/gmax：r2=0.65，P＜0.001；T/M：r2=0.87，P＜0.001）。

綜上所述，本研究建立的ER陽性人乳腺癌原位動物模型方法，能保持ER高表達的特點，成瘤率高，周期短。18F-FES可準確評價不同類型荷人乳腺癌模型的ER表達水平，能為進一步監測內分泌療效及設計治療方案提供準確方法。

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Evaluation of estrogen receptor expression by18F- fl uoroestradiol PET/CT imaging in human breast cancer

model HE Simin1，2，3，4， LUO Jianmin1，2，3，4， ZHANG Jianping1，2，3，4， ZHANG Yingjian1，2，3，4（1.Department of Nuclear Medicine， Fudan University Shanghai Cancer Center； Department of Oncology， Shanghai Medical College， Fudan University， Shanghai 200032， China； 2.Department of Nuclear Medicine， Shanghai Proton and Heavy Ion Center，Shanghai 201321， China； 3.Center for Biomedical Imaging， Fudan University， Shanghai 200032， China； 4.Shanghai Engineering Research Center for Molecular Imaging Probes， Shanghai 200032， China）

ZHANG Yingjian E-mail： yjzhang111@aliyun.com

Objective： To evaluate estrogen receptor （ER） expression level in human breast cancer model using18F-f l uoroestradiol （18F-FES） microPET/CT. Methods： ER+human breast cancer cell lines （ZR-75-1 and MCF-7） and ER-control（MDA-MB-231） were used to construct BALB/c nude mouse model. There were ten mice in each ER+group. The estrogen pellets were implanted 3 d prior to tumor cell inoculation and removed 3 d before administration of18F-FES. The mice were implanted with ZR-75-1 and MCF-7. There were 5 mice in ER-group. MDA-MB-231 cells were inoculated into thoracic mammary fat pad.18F-FES PET/CT was performed until the tumor length reached 5 mm. %ID/gmaxwas used to quantitate ER expression. ER expression was also detected by immunohistochemistry. Results： The tumor formation rates for ZR-75-1， MCF-7 and MDAMB-231 were 100% （10/10）， 70% （7/10） and 100% （5/5）， respectively. There was no statistical difference in the volume among three groups （P＞0.05）. %ID/gmaxvalues were 6.6±1.0， 3.3±0.5 and 1.1±0.1， respectively. Signif i cant differences were observed when ZR-75-1 was compared to MCF-7 （P＜0.05） and MDA-MB-231 （P＜0.001）. There was signif i cant difference between MCF-7 and MDA-MB-231 （P＜0.05）. The ratios of tumor to muscle （T/M） were 4.2±0.3， 2.6±0.2 and 1.1±0.1， respectively. There were signif i cant differences among three groups （P＜0.001）. A signif i cantly positive correlation was found between the resultsof18F-FES imaging and immunohistochemistry （%ID/gmax： r2=0.65， P＜0.001； T/M： r2=0.87， P＜0.001）. Conclusion： %ID/gmaxfrom18F-FES PET/CT imaging is able to evaluate ER expression reliably.18F-FES PET/CT can be used as a noninvasive and dynamic method in vivo.

Breast cancer model； Estrogen receptor；18F-f l uoroestradiol； PET/CT； MCF-7； ZR-75-1； MDA-MB-231

R445.6

A

1008-617X（2015）01-0035-06

2015-03-10

2015-03-21）

上海市科委項目（No：12431900208）；上海分子影像探針工程技術研究中心項目（14DZ2251400）。

章英劍 E-mail：yjzhang111@aliyun.com