革蘭氏陰性細菌外膜蛋白耐藥功能及其抑菌策略研究進展

李碗芯,孫莉娜,林向民

(1.福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室(福建農林大學)；2.福建省高校作物生態與分子生理學重點實驗室 ,福建福州350002)

革蘭氏陰性細菌外膜蛋白耐藥功能及其抑菌策略研究進展

李碗芯1 ,2,孫莉娜1 ,2,林向民1 ,2

(1.福建省農業生態過程與安全監控重點實驗室(福建農林大學)；2.福建省高校作物生態與分子生理學重點實驗室 ,福建福州350002)

當前細菌耐藥的形勢日益嚴峻 ,已引起全世界的廣泛關注.革蘭氏陰性細菌的耐藥性普遍比革蘭氏陽性細菌強 ,這與鑲嵌或錨定在革蘭氏陰性細菌外膜上的蛋白耐藥功能密切相關.目前已知外膜蛋白能夠阻礙抗生素通過外膜以及將抗生素排出胞外等方式使細菌產生耐藥性 ,但具體的耐藥與調控機制還有待進一步研究.近年來 ,隨著現代科學技術的不斷發展 ,特別是結構生物學、分子生物學與蛋白質組學在該領域的充分運用 ,有關外膜蛋白功能的研究和技術取得了很大的進步.本文對近年來國內外在細菌外膜蛋白的結構與耐藥機理、耐藥新功能及新機制等方面的研究進展進行了概述 ,為揭示革蘭氏陰性菌耐藥形成機制奠定基礎.

外膜蛋白；耐藥機制；藥物主動轉運系統；抑菌策略

由于抗生素的誤用與濫用 ,細菌的耐藥性正逐漸成為制約世界衛生健康和經濟發展的重要因素之一 ,這受到國內外研究學者的廣泛關注.從1983年至1987年 ,美國食品藥品監督管理局(Food and Drug Ad-ministration ,FDA)共批準16種抗生素上市 ,而1998年至2002年僅批準7種 ,2008年至2012年只批準了2種 ,抗生素的研發明顯慢于耐藥細菌產生的速度.2013年McKenna[1]報道 ,碳青霉烯類抗生素曾被認為是人類抵抗耐藥菌的最后一道防線 ,但目前已在全世界范圍內發現了針對此抗生素的超級耐藥菌株.因此 ,細菌耐藥機制的研究與新型藥物作用靶點的篩選迫在眉睫 ,其已成為新型抗生素開發的重要研究領域 ,是當今科學研究的熱點問題.

革蘭氏陰性細菌的耐藥性能普遍比革蘭氏陽性細菌強 ,其中一個很重要的原因在于革蘭氏陰性細菌多了一層外膜 ,外膜上的蛋白具有控制營養物質或如抗生素等小分子進出的功能 ,稱之為外膜蛋白(outer membrane protein ,OMP).除了部分錨定在外膜內部或外部的脂蛋白以外 ,大部分外膜蛋白均由8－22個跨膜鏈 ,以反向平行方式通過相鄰鏈間的氫鍵作用形成β-桶狀結構(β-barrel).跨膜鏈的數量決定了外膜蛋白的拓撲結構 ,從而導致孔徑的不同[2].如大腸埃希氏菌(Escherichia coli)的OmpA、OmpF、TolC和OmpW等蛋白的結構與功能具有代表性和特殊性.Nikaido et al[3]認為 ,外膜蛋白可以通過啟動細菌主動藥物轉運系統(efflux pump systems)和改變細胞外膜的通透性而誘導細菌耐藥特性的形成.

1 外膜蛋白的結構與耐藥功能

1.1 細菌主動藥物轉運系統

主動藥物轉運系統又稱外排(efflux) ,可以通過外膜蛋白與周質空間蛋白和內膜蛋白組成的復合物系統 ,將抗菌藥物泵出細胞外.在目前已知的與抗生素抗性有關的外膜蛋白中 ,TolC是一個廣泛報道的參與外排廣譜性抗生素藥物的多功能外膜蛋白.1996年Nikaido[4]和Fralick[5]幾乎同時發現TolC與周質空間蛋白ArcA和內膜蛋白ArcB形成的復合物具有重要的多重藥物外排功能；隨后在產氣腸桿菌(Enterobacter aerogenes)、豬布魯氏桿菌(Brucella suis)等革蘭氏陰性細菌中相繼發現 ,TolC的同源蛋白也具有外排抗生素的功能[6－7],形成如銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)的MexA-MexB-OprM和MexC-MexD-OprJ、副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus)的VmeA-VmeB-TolC等復合物 ,統稱為多重耐藥外排系統[8].

結構生物學研究顯示 ,TolC可形成特殊的三聚體結構 ,3個亞基在外膜處由12條β折疊鏈共同組成一個β-桶狀結構 ,并在周質空間處由12個α-螺旋形成內空的通道[9].TolC長桶狀的結構使其容易在Ar-cA的協助下與AcrB結合 ,形成連接細胞內外物質運輸的特殊通道 ,在質子動力勢的作用下將抗生素排出胞外[10－11].此外 ,TolC可以與主要易化子(major facilitator superfamily ,MFS)家族和ABC超家族(ATP bind-ing casssette superfamily)相互作用.目前已知的與抗生素抗性相關的大腸埃希氏菌外膜蛋白復合物 ,大部分與TolC相關 ,包括AcrAB、AcrAD、AcrEF、MdtEF、MdtABC和MacAB等系統[5 ,12－14],可以外排如疏水性溶劑以及β-內酰胺類、萘啶酮酸和氨基糖苷類等多種抗生素.由于TolC蛋白在細菌耐藥中的重要作用 ,缺失tolC基因的菌株對廣譜性抗生素的敏感性顯著下降[15].

1.2 改變細胞外膜的通透性

從20世紀90年代至今 ,研究人員從蛋白的結構、功能以及基因組序列預測等方面對涉及泵外排系統的外膜蛋白進行了系統的研究 ,并取得重大進展.但多數研究集中在外膜蛋白空間結構和孔徑大小與抗生素的相互作用方面 ,有關這些蛋白的耐藥功能與調控機制的研究并不多.研究比較透徹的涉及抗生素攝取的外膜蛋白為OmpC和OmpF超家族 ,這是大腸埃希氏菌細胞外膜上的2個主要孔道蛋白 ,對一定大小的親水性小分子物質具有非特異通道的屬性.這2個蛋白具有很高的同源性 ,結構和功能也相似.但是通過對多種不同分子大小的有機分子的滲透率的研究發現 ,OmpF的孔道半徑比OmpC至少大6倍 ,使得β-內酰胺類抗生素、膽酸等有毒物質更易從OmpF的通道通過；而OmpC可以允許分子質量小于600 u的親水性溶質或離子通過[16].這2個外膜蛋白對不同抗生素有不同的敏感性 ,ompF基因缺失可顯著增強菌株對氟諾沙星、四環素、頭孢菌素、先鋒霉素、氨芐青霉素和頭孢西丁的耐藥性 ,輕微提高對氯霉素的耐藥性；ompC缺失則可增強菌株對頭孢菌素和頭孢西丁的耐藥性 ,而對氟諾沙星、氯霉素和四環素不敏感[17－18].但是 ,OmpC與OmpF并不僅是簡單的抗生素通道 ,細菌還可以根據外界環境的變化 ,調節其表達以維持外膜通透性的動態平衡.例如 ,在高滲透壓或高溫環境下 ,OmpC表達升高 ,而OmpF表達降低 ,從而減少分子質量相對大的溶質分子進入細胞[19].深入研究發現 ,這一對外膜蛋白受細菌雙調節系統(two-component regulatory sys-tem ,TCS)OmpR/EnvZ和CpxR/CpxA的綜合調控.Lin et al[20]發現 ,這2對雙調節系統在金霉素和萘啶酮酸抗生素刺激下 ,OmpC和OmpF的表達呈現不同的調節模式.其中 ,在金霉素作用下 ,雙調節系統綜合調控導致OmpC和OmpF的表達均降低；在萘啶酮酸作用下 ,OmpC表達明顯升高 ,而OmpF表達降低.

除了OmpC和OmpF家族蛋白 ,還有一些外膜蛋白參與了細菌對抗生素攝入的控制 ,如結核桿菌(My-cobacterium tuberculosis)的CpnT以及銅綠假單胞菌的OprD等 ,但在這些方面的研究相對較少[21－22].

1.3 新耐藥相關外膜蛋白的發現

細菌外膜蛋白可以通過增加抗生素的外排和減少抗生素的進入使細菌產生耐藥特性 ,但有關外膜耐藥蛋白的種類、功能和特點還需要深入系統的研究.以大腸埃希氏菌為例 ,外膜蛋白的基因注釋至少有82個 ,而目前報道具有耐藥功能的卻不多 ,這與有些外膜蛋白屬于低豐度蛋白或只在特定條件下表達等因素有關；此外 ,抗生素的不同抑菌機制也對研究造成了一定難度.

運用定量蛋白質組學技術研究細菌耐藥機制 ,使大規模尋找抗生素作用靶點和耐藥功能蛋白成為可能.我國學者利用基于2DE的外膜蛋白亞蛋白質組學技術對耐不同抗生素細菌的外膜蛋白功能進行了系統的研究 ,發現在大腸埃希氏菌中 ,除了TolC、YhiU、OmpC和OmpF等常見耐藥功能蛋白以外 ,FimD、OmpT、Tsx、YfiO、OmpW、LamB、NlpB和FadL等多個外膜蛋白也與鈉啶酮酸、鏈霉素、金霉素、氨芐青霉素和四環素的耐藥性相關[23－25].Peng et al[26]對抗氨芐青霉素、卡那霉素和四環素的銅綠假單胞菌外膜蛋白組分進行比較 ,發現了11個耐藥相關外膜蛋白 ,其中10個外膜蛋白為以往報道.此外 ,國內外學者還運用蛋白質組學方法鑒定了如溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的OmpU、OmpN、VPA1644和VPA0526 ,鮑氏不動桿菌(Acinetobacter baumannii)的OmpA、CarO和OmpW等耐藥相關外膜蛋白[27－28].

1.4 外膜蛋白的其他耐藥功能

外膜及外膜蛋白常常被形容為進出革蘭氏陰性細菌的一扇“門” ,通過進入和外排系統使細菌產生耐藥性.然而 ,近年來學者們發現外膜蛋白還可能存在其他的耐藥途徑.Lin et al[23]對外膜蛋白LamB的耐藥功能進行了深入研究 ,發現大腸埃希氏菌的外膜蛋白LamB在耐藥菌株中的表達普遍下調 ,缺失lamB導致金霉素在細胞內積聚 ,菌株耐藥性升高4倍以上 ,其補救菌株可恢復到野生菌株的耐藥能力.報道顯示 ,LamB除了是抗生素的非特異通道外 ,還可能介導一個重要的負調耐藥機制 ,該蛋白有可能與其他蛋白相互作用而行使耐藥功能.Lin et al[29]通過免疫共沉淀及免疫印跡方法 ,成功發現了一個LamB的復合物蛋白Odp1.該蛋白是丙酮酸脫氫酶復合體E1的組成部分 ,在調控糖酵解、TCA循環以及ATP生成等體內重要生化代謝途徑中起限速酶的作用.在利用iTRAQ定量標記研究大腸埃希菌應對金霉素以及嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)應對土霉素應激時 ,也發現LamB相關蛋白、Odp1以及能量生成相關基因表達下降的現象 ,進一步證實LamB在耐藥中的負調作用可能普遍存在于自然進化的耐藥菌中 ,且具有多物種、多重耐藥的特性[30－31].前人研究結果說明LamB是細菌體內的耐藥關鍵蛋白.其與Odp1相互作用 ,很可能通過限制糖類進入細胞并參與能量代謝效應的負調控 ,降低細菌體內的能量代謝與NADH濃度 ,最終導致細菌耐藥.

綜上所述 ,外膜蛋白除了改變細胞外膜的通透性和啟動主動藥物轉運系統以外 ,還可能有很多新的耐藥功能等待探索.

2 蛋白相互作用平衡網絡

由于抑制TolC、OmpC及OmpF等外膜蛋白耐藥作用的新藥物不斷出現 ,人們一度認為抗生素耐藥的問題已得到解決 ,但事實并非如此.研究發現 ,即使是缺失tolC基因的菌株 ,在亞致死抗生素濃度下傳代培養一定代數后 ,又可以迅速獲得藥物抗性.Li et al[25]對該現象進行了系統的分析 ,發現細菌在耐藥過程中 ,并不只是幾個外膜蛋白發生了變化 ,而是形成了蛋白相互作用的動態平衡網絡 ,即當一個重要外膜蛋白被抑制后 ,細菌為了生存 ,將調節外膜上的其他蛋白表達 ,形成一個耐藥相關外膜蛋白相互作用網絡 ,最終導致細菌耐藥.例如 ,在缺失tolC的大腸桿菌耐鏈霉素菌株中 ,OmpW和Dps表達升高 ,而OmpT和LamB表達下降；而在缺失lamB的耐藥菌株中 ,OmpW表達上升 ,FadL、OmpT和Dps表達均下降.由此表明 ,研究這些耐藥相關外膜蛋白在不同抗生素中的變化方式、相互作用網絡及其復雜的調控機制 ,對深入闡明細菌的耐藥新機制具有重要意義.

3 外膜蛋白抑制細菌耐藥策略

面對當前嚴峻的細菌耐藥形勢 ,舊抗生素和同類型抗生素已達不到抑菌的效果 ,人們亟需開發新型抑菌機制的藥物.鑒于細菌外膜蛋白在耐藥中的重要作用 ,近年來開發了以多種外膜蛋白為藥物靶點的抗耐藥菌藥物.

3.1 增強細菌外膜蛋白通透性的藥物

研究證實 ,許多藥物在還未進入細菌內部就被細菌外膜蛋白通道擋在作用靶點之外 ,一些諸如多黏菌素、氨基糖苷類和大環內酯類的抗生素可以通過增加外膜蛋白的通透性達到抗菌作用.一些小分子物質也具有類似功能 ,如精胺可以抑制大腸桿菌OmpF的通道 ,尸胺通過抑制離子通道降低細菌對氨芐青霉素和頭孢菌素Ⅱ的耐藥性[32－33].

3.2 抑制細菌外排泵功能的藥物

近年來發展了一系列抑制外排泵功能的藥物.根據其作用機理分為以下幾類.

(1)干擾外排泵組裝的抑制劑.外排泵系統一般由外膜、質膜和周質空間蛋白復合物組成.抑制外排泵上相關蛋白的合成或占據其功能位點 ,外排系統就無法行使其功能.例如 ,Globomycin可以抑制結核桿菌AcrAB-TolC中AcrA前體的形成 ,從而阻斷了外排泵的功能[34].

(2)阻斷外排泵能量來源的抑制劑.除ABC型外排泵是依賴ATP水解驅動外 ,其余外排泵系統均是由質子動力勢驅動 ,因此破壞質子動力勢的來源可以使外排系統崩潰.羰基氰化氯苯腙(CCCP)可以破壞跨膜電化學梯度 ,是體外試驗常用的強電子解偶聯劑 ,對NepAB、EmrAB、MexAB、AcrAB以及SdeAB等復合物均有抑制作用[35－36].但是由于其副作用較強 ,臨床上選用與其作用機制相同且毒性較小的奧美拉唑(omeprazole)和蘭索拉唑(lansoprazole)為質子泵抑制劑[37].

(3)直接抑制或競爭外排泵系統的抑制劑.苯丙氨酸－精氨酸－β－萘酰胺(PAβN)是常見的廣譜性外排泵抑制劑 ,其可以與抗生素競爭RND家族外排泵 ,使抗生素集聚在細胞內 ,達到殺菌效果.此類抑制劑還包括抑制銅綠假單胞菌AcrB和MexB的MC-207、110及其衍生物 ,以及抑制產氣腸桿菌等細菌AcrAB的喹啉衍生物等[38－39].

(4)抑制藥物特異外排泵的藥物.Tet泵是由質粒編碼 ,表達在細菌膜上的特異外排泵.研究發現 ,13-CPTC是米諾環素衍生物 ,可以與四環素競爭結合Tet外排泵 ,并堵塞該泵 ,從而提高四環素在胞內的濃度[40].

(5)特異性抗體抑制外排泵的藥物.如上所述 ,革蘭氏陰性細菌的外膜蛋白是細菌多重耐藥系統的重要組成部分 ,如果以該蛋白作為靶點 ,利用特異性抗體與靶點的結合 ,可對耐藥細菌起到明顯的抑制作用. Li et al[25]研究發現 ,當TolC抗體靶向耐鏈霉素或氯霉素的大腸埃希菌外膜TolC后 ,明顯提高了細菌對抗生素的敏感性 ,與缺失該蛋白的表現結果相似.以上研究說明 ,特異外膜蛋白靶點的抗體配合低濃度抗生素可以有效抑制耐藥菌 ,是一種潛在的抑菌藥物 ,具有廣闊的應用前景.

(6)適配體靶向抑制藥物.適配體(aptamer)是人工合成的一段隨機DNA、RNA或肽 ,其在足夠長的序列下 ,理論上可以形成任何三維結構.因此 ,經過幾次篩選后 ,可以找到與靶點特異性結合的核酸或肽段序列.相比抗體 ,適體技術可以高效、大規模篩選和生產特異靶點序列 ,且這些分子更容易進入細胞 ,藥效更穩定持久.該技術已被應用于新型抑菌藥物的開發、特異配體序列的尋找以及生物大分子結構與功能研究等多個領域[41].例如 ,Li et al[42]設計了與致病大腸桿菌K88 pili特異結合的DNA適配體 ,使病原菌鞭毛蛋白無法結合到宿主表面的受體 ,進而不能入侵宿主 ,并且已經在體外取得顯著效果.此外 ,陳伶利等[43]利用適配體技術篩選出23個與TolC特異結合的DNA序列 ,可作為外排泵的抑制劑.

3.3 新型抑菌策略

根據外膜蛋白是多種必需營養物質進出通道的特性 ,可將抗生素與細菌生存必需物質偶聯 ,“騙”過外膜屏障到達細胞內 ,從而增加胞內抗生素濃度 ,該新型抑菌策略稱為“特洛伊木馬”策略.例如 ,鐵離子是細菌生命活動必需的金屬元素 ,革蘭氏陰性細菌只能靠從外界環境攝取可以螯合鐵離子的鐵載體 ,并通過外膜蛋白特異通道運輸到細胞內.含鐵蛋白缺乏會導致細菌死亡 ,細菌很難進化出阻擋該類物質進入胞內的機制.事實上 ,這種方法早已在自然界中存在 ,一些細菌可以分泌與鐵離子螯合物共價結合的抗生素 ,通過特異外膜蛋白通道進入胞內從而起到殺菌作用 ,如白霉素等[44].根據此原理 ,科研人員將抗生素或納米殺菌材料與鐵載體人工偶聯在一起 ,研發出高效新型抗生素 ,這將是今后該領域發展的一個重要方向[45].

4 總結與展望

綜上所述 ,由于全球細菌耐藥的形勢日益嚴峻 ,了解細菌耐藥與調控新機制 ,設計藥物新靶點和抑菌新策略 ,已成為當前科學研究的熱點問題.現有研究發現 ,革蘭氏陰性細菌的外膜蛋白具有重要的耐藥功能.外膜蛋白可以通過控制外膜通道孔徑大小限制抗生素進入細胞 ,還可以通過單體或復合物的方式形成外排系統將已進入胞內的抗生素泵出細胞外 ,前者的典型代表為OmpC和OmpF家族 ,后者有TolC家族及其復合物TolC-AcrAB.但是 ,很多外膜蛋白的耐藥功能及其調控機制還有待進一步研究.目前 ,通過高通量的組學技術發現了更多的耐藥相關差異蛋白及其調控機制 ,但這些蛋白是否具有耐藥功能 ,還需要進一步驗證.因此 ,分子生物學技術與多“組學”方法結合 ,特別是代謝組學的發展 ,將是今后細菌耐藥機制研究的重要方向.此外 ,外膜蛋白介導的其他耐藥新機制以及耐藥導致外膜蛋白形成差異表達平衡調控網絡的發現 ,使有關細菌耐藥的內在機理更加清晰 ,這揭示今后的耐藥治療更傾向于多種藥物的協同作用[46].

現有的外膜蛋白耐藥理論知識 ,為新型抗耐藥菌藥物的研發奠定了基礎.目前已研發出各種抑制耐藥外排系統和增加外膜通透性的藥物；但是 ,該領域的研究還面臨諸多問題 ,如藥物的理化性質、溶解性、特異性 ,特別是對哺乳細胞的毒性問題 ,都未得到很好的解決 ,因此多數藥物仍然處于科學研究階段 ,無法用于臨床[47].總之 ,細菌耐藥過程是一個復雜的生物學過程 ,細菌采取進化突變的策略快速產生耐藥性 ,但還有很多耐藥機制和復雜調控網絡有待進一步研究.

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(責任編輯:楊郁霞)

An review on the antibiotics resistance function of outer membrane protein in gram-negative bacterial and related antimicrobial strategies

LI Wan-xin1 ,2,SUN Li-na1 ,2,LIN Xiang-min1 ,2
(1.Fujian Provincial Key Laboratory of Agroecological Processing and Safety Monitoring ,Fujian Agriculture and Forestry University；2.Key Laboratory of Crop Ecology and Molecular Physiology in Universities of Fujian Province ,Fuzhou ,Fujian 350002 ,China)

The emergence of bacterial resistance to drug use has posed serious problem worldwide.Generally ,the drug resistance ca-pability of gram-negative bacteria is stronger than that of gram-positive ,which is partially attributed to the antibiotics resistance of the outer membrane proteins(OMPs).It is well known that the specific OMPs efflux antibiotics out or inhibits uptakes of antibiot-ics ,while the regulation mechanism remains uncertain.With the development of modern science and technology ,especially the ap-plication of structure biology ,molecular biology and proteomics ,many progressive studies have unveiled the mechanisms underlying the antibiotic resistance of OMPs.This review focuses on the recent advances in the structure and antibiotic resistance mechanisms of OMP ,which provides helpful insight into manufacture of new OMPs-targeting antimicrobial drug.

outer membrane protein；antibiotics resistance mechanism；efflux pump system；antimicrobial strategy

Q93-3

A

1671-5470(2015)06-0561-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2015.06.001

2015－03－20

2015－07－02

國家自然科學基金項目(31470238、31200105).

李碗芯(1990－) ,女 ,碩士.研究方向:分子生態學.Email:liwx2012＠126.com.通訊作者林向民(1977－) ,男 ,教授 ,博士生導師.研究方向:微生物學、分子生態學.Email:xiangmin＠fafu.edu.cn.