納米磁分離技術在食品微生物快速檢測領域的應用

甘 蓓 胡曉云 胡文斌 甘冬蘭

(1.江西省產品質量監督檢測院，江西南昌 330029;2.江西省食品檢驗檢測研究院，江西南昌 330046;3.南昌大學圖書館，江西南昌 330029)

1、食品微生物快速檢測

食品安全檢測的對象包括:藥物殘留(含農藥、獸藥)、非法添加物、重金屬污染、有機污染物、生物毒素以及微生物污染。

由于食品中組分復雜，而目標分析物的含量較低。因此，除微生物外的目標分析物，往往要通過復雜的樣品前處理過程，達到分離和純化，然后再進行儀器分析。在樣品前處理過程中，萃取、過濾、過柱、旋轉蒸發、氮吹等等一系列繁瑣步驟不可避免;而且自動化程度低，對人員要求較高;有機試劑消耗大，對環境造成不可避免的污染。

而微生物污染，往往采用傳統方法分離，通過增菌、選擇培養、分離純化、生化鑒定和血清鑒定等步驟，過程繁瑣耗時長。通常需要3～7天，更有甚者長達10天時間。

在食品安全事件頻發的今天，快速檢測已成為一種趨勢。為了滿足需要，食品微生物檢測朝著檢驗時間短、操作簡單、更加環保的方向發展。隨著分子生物學技術、免疫學分析檢測技術、生物傳感器技術和納米磁分離技術等新技術在食品安全檢測中的應用，使得食品微生物快速檢測技術迅速發展。

2、納米磁分離技術

納米技術是20世紀80年代發展起來的一門多學科交叉融合的技術科學。隨著納米技術的發展，磁性納米粒子開始走入科研人員的視野。磁性納米粒子(Magnetic Nanoparticles，MNPs)是指含有磁性金屬或金屬氧化物的超細粉末且具有磁響應性的納米級粒子，具有獨特的超順磁性能［1］。磁分離技術(Magnetic Separation，MS)正是借助了磁性納米粒子的超順磁性，通過對磁性納米顆粒的表面修飾，使納米粒子既具有功能化基團，又具有磁性。通過功能化基團與目標物質之間的特異相互作用，以及外加磁場作用，實現對靶向目標物質的快速分離［2］。

磁性納米粒子用于微生物檢測分析過程具有以下幾個方面的優勢:

(1)粒徑小，不容易發生沉降;懸浮穩定性好，能高效地與目標產物進行偶聯;且具有較大的比表面積，吸附容量大。

(2)具有超順磁性:在外加磁場的存在下，磁性微粒有較好的響應性，能迅速聚集，當撤去外加磁場時，磁性微粒無磁性記憶，能夠均勻分散，不出現聚集現象。

(3)具有豐富的表面活性基團，可以特異結合各類具有生物活性的物質，如生物酶，蛋白質等;也可在其表面結合特異性靶向分子，如特異性抗體等進而應用于致病性微生物的分離。

(4)操作簡便，在外磁場的作用下便可進行磁粒的反復分離，分離過程十分簡單，可省去離心，過濾等繁瑣操作，節約時間，與目前已有微生物檢測方法相比，具有較好的優勢。

(5)磁性微粒具有一定的機械強度和化學穩定性，能耐受一定濃度的酸堿溶液和微生物的降解。對微生物檢測中的樣品沒有特別的要求，不需要調節樣品溶液的pH。

磁性微球制備方法:共沉淀法、懸浮聚合法、乳液聚合法、分散聚合法、包埋法及原子轉移自由基聚合法等。常用的磁性納米粒子的表面修飾物主要有非聚合物、聚合物、無機物和目標配體等［3］。修飾物可以通過表面聚合、表面化學連接、吸附沉積、包埋等方法與磁性納米粒子結合，達到降低粒子表面能、調節粒子分散性和生物親和性、提高與目標檢測物質結合性的目的。

3、磁分離技術在食品微生物快速檢測領域的應用

3.1 食品微生物檢測中常見的致病菌

食品中常見的微生物檢測主要是菌落總數、大腸菌群和致病菌檢測，其中致病菌鑒定周期長、步驟繁瑣。食品中致病菌主要有沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、單增李斯特菌、溶血性鏈球菌、阪崎腸桿菌、大腸桿菌O157:H7、產氣莢膜梭菌、銅綠假單胞菌和糞鏈球菌等。

3.2 磁分離技術分離致病菌的原理

磁分離技術在食品微生物檢測中的應用，主要是通過磁性納米材料的表面生物修飾達到富集。將生物親和分子修飾到磁性納米材料的表面，通過生物親和分子捕獲樣品溶液中的目標菌，使目標菌帶有磁性，從而達到易分離的目的。目前，磁性納米材料捕獲致病菌的方式主要有四類，一是利用抗原－抗體反應;二是凝集素－受體反應;三是抗生素識別反應;四是DNA互補序列識別反應［4］。目標菌通過結合磁珠，在外加磁場的作用下，與樣品溶液分離。通過不同的檢測手段(如傳統平板計數、ATP生物發光分析、生物傳感器技術、PCR技術、紅外光譜、熒光光度計等)，最終達到從各類基質中分離并檢測食品中食源性致病菌的目的。

3.3 磁分離技術在食品微生物快速檢測領域的應用實例

3.3.1 大腸桿菌 O157∶H7

利用抗原抗體反應原理制成的免疫磁珠分離大腸桿菌O157∶H7，已經被英國公共健康服務實驗室認定為標準的分離方法。我國也已將免疫磁珠法對大腸桿菌O157的檢測納入國家標準(GB/T 4789.36－2008)和出入境檢驗檢疫行業標準(SN/T 1059.5－2006)。Decory等建立了免疫磁珠－免疫脂質體(IMB/IL)熒光試驗方法，可在8h內快速檢測出多種液態樣品(水樣、蘋果汁、蘋果酒)中低至1cfu/mL的 E.coli O157∶H7。［5］

3.3.2 單增李斯特菌

傳統的單增李斯特菌檢測方法檢測周期長，約5～14d，步驟繁瑣且靈敏度低，而免疫磁分離技術的優點在于在較低的菌液濃度時也可以通過免疫磁珠的富集作用進行檢測，縮短了檢測時間并進一步降低了單增李斯特菌的檢測限。2008年，我國將免疫磁珠檢測單核細胞增生李斯特菌的方法納入了出入境檢驗檢疫行業標準中(SN/T 0184.3 －2008)。

較傳統分離技術而言，磁分離技術大大縮短了食品微生物檢測的時間，通過與生物傳感器技術、ATP生物發光分析等技術的結合，較容易實現食品微生物檢測的自動化。節省大量人力物力。

3.3.3 金黃色葡萄球菌

陳伶俐等將人IgG結合到磁珠上，用該磁珠對樣品中的金黃色葡萄球菌進行快速分離檢驗。對磁珠所涂平板的菌落進行鑒定，證明為金黃葡萄球菌。同時用大腸桿菌和白葡萄球菌進行對照，發現應用此法分離檢驗金黃色葡萄球菌，富集速度快，靈敏度高，效果好。［6］劉琳琳利用自制的金屬螯合免疫磁珠來檢測食品中金黃色葡萄球菌，該法能夠在30min內富集檢測金黃色葡萄球菌且檢測低限可達100 CFU，同時磁珠可保持活性達3周以上。［7］

綜上所述，磁性納米技術越來越多應用在食品微生物檢測領域中，使得今后的食品微生物快速檢測能夠實現快速、在線檢測。

［1］朱屯，王福明，王習東.國外納米材料技術進展與應用［M］.化學工業出版社，2002，6:69－77.

［2］SAFARIK I，SAFARIKOVA M.Magnetic nanoparticles and biosciences［J］.Monatshefte für Chemie，2002，133(6):737－759.

［3］AGUILAR － ARTEAGA K，RODRIGUEZ J A，BARRADO E.Magnetic solids in analytical chemistry:a review［J］.Analytica Chimica Acta，2010，674:157 －165.

［4］黃小林，許恒毅，熊勇華，等.磁性納米材料在食源性致病菌分離中應用的研究進展［J］.食品科學.2014，35(11).

［5］DECORYTR，DURSTRA，ZIMMERMANSJ，etal.Development of animmuno magnetic bead－immunoliposome fluorescence assay for rapid detection of Escherichiacoli O157:BH7 in aqueous sample sand comparison of the assay with a standard microbiological method［J］.Applied and Environmental Microbiology，2005，71(4):1856 －18641.

［6］陳伶俐，劉琳琳，曾力希，等.金黃色葡萄球菌及SPA快速分離檢驗新技術的研究［J］.中華微生物學和免疫學雜志，2011，19(2).112 －114.

［7］劉琳琳.免疫磁性微球快速分離檢驗金黃色葡萄球菌新技術的研究［J］.山東醫學高等?？茖W校學報，2011，39(7):579 －615.