分子生物學技術在產甲烷古菌多樣性研究中的應用

張瑞　雍曉雨　周俊　等

摘要：產甲烷菌在自然界中分布廣泛，是一類重要的嚴格厭氧原核微生物，其參與的產甲烷作用通常發生在厭氧發酵過程的最后一步，可將無機物或有機化合物最終轉化成甲烷和二氧化碳。由于產甲烷菌獨特的厭氧代謝機制，使其在自然界碳素循環過程中起著重要作用，因此對于產甲烷菌的多樣性以及代謝機制的研究越來越受到人們的關注。相對于傳統的培養檢測方法，分子生物學技術對于產甲烷菌的多樣性及其群落結構的檢測更為便捷、準確和科學。介紹了產甲烷古菌的系統分類學發展，系統地闡述了產甲烷菌定性和定量的分子生物學檢測方法，總結了不同技術在產甲烷菌多樣性研究中的最新成果，最后提出多種技術的復合應用將成為研究的熱點。

關鍵詞：產甲烷古菌；生物多樣性；分子生物學技術；檢測；復合應用

中圖分類號： Q939.97文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0016-05

收稿日期：2014-03-07

基金項目：國家“973”計劃（編號：2013CB733502）；國家自然科學基金（編號：21307058、21207065）；中國科學院環境與應用微生物重點實驗室開放基金（編號：KLCAS-2013-05）；江蘇省農業自主創新資金[編號：CX（13）3045]；江蘇省高校自然科學研究面上項目（編號：13KJB610006）。

作者簡介：張瑞（1990—），女，江蘇連云港人，碩士，主要從事微生物和分子生物學的研究。E-mail：zhangrui1030@njtech.edu.cn。

通信作者：鄭濤，男，教授，主要從事生物能源、生物材料方向的研究。Tel：（025）58139929；E-mail：zhengtao@njtech.edu.cn。能源和環境是制約當今世界經濟可持續發展的兩大關鍵問題，可再生生物質能源的研究顯得尤為重要。沼氣是最早被人們開發并獲得廣泛應用的一類可再生能源。沼氣所產生的能量不僅能夠減少化石能源的消耗，而且可以大大減少溫室氣體的排放，同時具有極大的經濟效益，因此關于沼氣的研究在世界范圍內引起廣泛的關注[1]。

微生物群落結構的組成決定其所具有的生態功能，對參與某一特定生物化學轉化作用的微生物菌群的定性和定量研究對于探討其參與反應的機理及關鍵步驟的解析具有重要的意義。沼氣的產生是由多種微生物菌群協同參與的復雜轉化過程，參與菌群可大致分為3類：水解和發酵細菌、專性產氫產乙酸菌和產甲烷古菌[2]。產甲烷菌作為厭氧發酵過程最后一步的關鍵菌群，其群落的組成和數量的變化將直接影響沼氣發酵速率和最終的產氣量。

產甲烷古菌大多以甲酸、甲基化合物、乙酸、H2/CO2為底物原料。近年來，隨著Hungate厭氧操作技術的發展，人們對于產甲烷菌的研究越來越多。產甲烷菌存在于各種極端厭氧環境中，且在不同的生態環境下，產甲烷菌的群落組成也存在差異，其代謝過程也隨著環境的不同而體現出多樣性[3]。自然界中甲烷主要由3 種途徑產生：乙酸發酵途徑、氫營養型途徑 （亦稱CO2還原途徑） 和甲基營養型途徑。不同條件下，各個途徑對甲烷生成的貢獻率不同。近年來隨著分子生物學技術的發展，如16S rRNA克隆文庫技術、變性梯度凝膠電泳技術、限制性酶切片段長度多態性分析技術和穩定同位素核酸探針技術等多種分子生物學技術的應用，克服了傳統培養方法所帶來的的形態和生理的變化及不可培養微生物種群缺失的缺陷，使得人們對于產甲烷菌的群落組成及其代謝機制、動力學研究越來越深入。全面準確地了解參與沼氣發酵的微生物種群結構，特別是產甲烷古菌的群落組成和結構變化規律，能夠為沼氣發酵過程的設計優化、微生物代謝調控等提供可靠的技術參數。

1產甲烷古菌的系統分類學發展

1974年，Bryant 首次提出了產甲烷菌（Methanogen）這一概念，將其與以甲烷為能量來源的嗜甲烷菌（Methanotrophs）區分開來[4]。2001年，《伯杰氏系統細菌學手冊》將產甲烷菌放在寬廣古生菌門（Euryarchaeota）中。他們廣泛存在于各種厭氧環境中，如海水沉積物、湖泊沼澤及動物瘤胃、盲腸等自然生態系統環境中；也存在于廢水、稻草秸稈、禽畜糞便等非自然生態環境中[5]。產甲烷菌分類形式多樣，傳統的分類是基于微生物的形態結構、生理生化特性等為依據進行的，鑒于產甲烷菌生長條件苛刻，生長速率一般較低，生物量也較少，培養方法特別，其所能利用的底物種類較少，且染色、形態特征也比真細菌易變和難確定，給傳統分類法帶來極大的挑戰。迄今為止，僅有200多種產甲烷菌被分離鑒定出來，歸屬于3綱5目10科29個屬[6]。其中5目分別為甲烷桿菌目（Methanobacteriales）、甲烷球菌目（Methanococcales）、甲烷微菌目（Methanomicrobiales）、甲烷八疊球菌目（Methanosarcinales）、甲烷火菌目（Methanopyrales）[7]。隨著分子生物學的發展，人們更多地利用系統發育學分類法，依據物種間小亞基核糖體核苷酸的差異性對產甲烷菌進行鑒定和分類[8]。

2分子生物學技術在產甲烷古菌多樣性中的應用

產甲烷古菌群生活在極端厭氧環境中，對溫度、pH值、底物濃度等因素非常敏感。Hungate厭氧操作技術的應用與發展使得產甲烷古菌的純培養成為可能。然而傳統的培養方法較為繁瑣，且無法保持微生物生態環境的一致性，而分子生物技術因其在非培養條件下對微生物遺傳信息進行研究，從而被認為是產甲烷菌研究的重要且有效的手段。1996年，伊利諾伊大學第一次完成了產甲烷菌Methanococcus jannaschii的基因組測序。近年來，人們越來越多地以基因組遺傳信息為依據，并運用分子生物學技術來研究物種的種群多樣性、群落結構組成、菌群功能及其代謝機理。這些分子生物學技術，例如變性梯度凝膠電泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）、限制性片段長度多態性分析（restrictionfragment length polymorphism，RFLP）、末端限制性片段長度多態性分析（terminal-restriction fragment length polymorphism，T-RFLP）、熒光原位雜交技術（florescence in situ hybridization，FISH）等的引入，將產甲烷古菌這一重要環境微生物的研究帶入了一個新時代。

2.116S rRNA/mcrA 基因克隆文庫分析

16S rRNA基因克隆文庫分析是在生物多樣性研究中最常用的分子手段之一。1990年，Giocannoni等首次應用該方法分析馬尾藻海海面的浮游微生物多樣性[9]。該方法是基于對樣品總DNA進行PCR克隆獲得目的基因16S rRNA片段，將其連入載體導入宿主菌中，挑選陽性克隆進行測序，構建克隆文庫，對所獲得的克隆序列進行生物信息學分析，構建系統發育樹，從而獲得樣品微生物系統多樣性。這些種系或者分類操作單元（operational taxonomic units，OTU）的數目直接反映了某一種生物類的豐富度[10]。

甲基輔酶M還原酶 （methyl coenzyme-M reductase，MCR） 是甲烷生成過程中的關鍵酶，其α亞基 （McrA，由mcrA基因編碼） 催化甲烷化反應中的最后一步，存在于所有產甲烷菌中[11]?；谄浯呋磻莫毺匦?，可作為檢測和區分產甲烷菌的分子標記[12]。1995年，Springer等成功驗證了mcrA探針用于產甲烷古菌多樣性分析的可行性[13]。Nolla-Ardèvol等利用mcrA基因序列分析中亞堿湖中產甲烷菌群，從而研究其作為高pH甲烷反應器接種物的適用性[14]。mcrA克隆文庫技術已日趨完善，并且在產甲烷菌的研究中發揮著不可替代的作用。產甲烷古菌多樣性分析中常用的引物序列可查閱文獻獲得（表1）。表1產甲烷古菌多樣性分析中常用的引物序列

引物名稱引物序列（5′→3′）PCR產物長度

（bp）參考文獻16S rDNAArchaeal21Fa：TTCCGGTTGATCCYGCCGGA；Archaeal958Ra：YCCGGCGTTGAMTCCAATT900Delong[15]MEME1：GCMATGCARATHGGWATGTC；ME2：TCATKGCRTAGTTDGGRTAGT760Hales等[16]MCRMCRf：TAYGAYCARATHTGGYT；MCRr：ACRTTCATNGCRTARTT500Springer等[13]

近年來，16S rRNA/mcrA基因的克隆文庫分析在沼氣工程中的應用越來越廣泛。2008年，Nettmann等首先將16S rRNA和mcrA分析應用于利用牲畜糞便以及玉米秸稈作為底物的中溫商業沼氣工程產甲烷古菌多樣性的研究中[17]。研究中發現超過70%的古菌OTU都屬于Methanomicrobiales，即耗氫型產甲烷菌，而乙酸型產甲烷菌占了很小的比重。從而推測CH4主要由H2和CO2途徑產生。然而基于 16S rRNA/mcrA 基因克隆測序分析的方法仍然存在其固有缺點，為了更全面地分析樣品的多樣性，需要構建大量的克隆，耗時較長，且成本昂貴[18]。隨著指紋識別技術的發展，通常將其二者結合使用來降低測序的費用[19]。

2.2變性梯度凝膠電泳

變性梯度凝膠電泳 （denatured gradient gel electrophoresis，DGGE） 最早由Fischer等提出，是用于檢測DNA片段點突變的一種技術[20]。DGGE是根據長度相同但堿基序列不同的DNA片段在不同濃度梯度變性劑中解鏈行為不同而在電泳時遷移速率不同這一機理，從而將某一樣品中不同種屬菌株的DNA片段區分開。凝膠不同位置所形成的條帶與樣品中的優勢菌群相關，再加以測序以及系統發育分析，進而可直接反映了樣品的生物多樣性。1993年，Muyzer等首次將其用于分析土壤環境中微生物群落結構研究中[21]。由于其可避免培養法所帶來的偏向性，在不改變樣品環境的情況下，對樣品微生物群落組成及其多樣性進行分析，因此又被廣泛應用到海洋、高溫、高鹽、厭氧污泥、污水處理等環境微生物多樣性的研究中。然而Hwang等利用DGGE對活性污泥厭氧反應器中的產甲烷菌群多樣性進行研究時發現，基于古細菌的16S rRNA基因擴增的DGGE分析不能完全反映出樣品中所存在的產甲烷菌分類[22]。這些差異性可能是由于PCR擴增、DNA提取或者是菌群本身的豐富度所造成的。因而DGGE一般并不單獨作為分析技術應用，而是輔以其他的方法，例如與原位分子雜交技術復合使用，應用于硫酸鹽還原菌的研究中[23]。Zakaria等利用FISH和DGGE發現Methanosaeta concilii是POME厭氧消化中的優勢菌群，它是乙酸型產甲烷的重要菌群以及屬于Methanosaeta潛在新菌的存在[24]。但當某種產甲烷菌含量較少，其DNA占總DNA量不足1%時，利用該技術很難檢測出。

2.3熒光原位雜交技術

熒光原位雜交技術是用已知的被熒光標記的單鏈核苷酸片段作為探針，按照DNA堿基互補的原則，與待測樣品基因組DNA 分子雜交，從而檢測該特異微生物種群的存在與豐度的一種方法。探針的特異性適用于任一分類學水平的測定，甚至可以區分個體間的差異。16S rRNA基因的寡核苷酸探針是比較常用的一類探針，其使用對微生物生態學具有重大意義。1993年，Wagner等率先將此技術應用于活性污泥微生物群落檢測中，之后此技術在應用中不斷得到完善[25]。劉春等采用熒光原位雜交技術對阿維菌素廢水工業化UASB反應器中顆粒污泥產甲烷菌群進行分析，發現產甲烷菌在不同粒徑的顆粒污泥表面和內部剖面中分布形態相同但分布豐度存在差異。同時，該技術也在不斷改進中，使其具有更大的適用性。Stoecker等用雙標記的寡核苷酸探針來替代單標記探針，在一定程度上加強了待測微生物種群的信號強度，同時提高了探針的有效性[26]。

2.4限制性酶切片段長度多態性

限制性酶切片段長度多態性（RFLP）是根據DNA在限制性內切酶酶切后形成特定DNA片段的大小不同而發展起來的一種DNA標記技術。然而酶切位點變異經常會受到一些因素影響而突變，從而導致RFLP結果的準確度降低。末端限制性酶切片段長度多態性（T-RFLP）是基于RFLP發展起來的一種方法，由于其利用特定的標記引物對樣品DNA進行特異擴增，之后進行限制性內切酶酶切，利用自動DNA測序儀對所獲熒光標記T-RFS的大小以及相對豐度進行測定，大大避免了RFLP的不足。T-RFLP作為一種高通量指紋識別技術已經被應用于微生物群落結構以及組成的變化研究中[27]。1997年，Liu等利用此技術研究復雜環境微生物多樣性，之后該技術被廣泛應用于各種生態系統中[28]。Lueders等采用T-RFLP和富集培養的方法研究水稻土壤中產甲烷菌的多樣性，發現大部分的產甲烷菌屬于Methanosarcinaceae、Methanosaetaceae和Methanobacteriaceae，并且鑒定出未被辨別的mcrA序列屬于RC-Ⅰ古菌成員[29]。Chin等利用 T-RFLP 技術和克隆文庫結合的方法分析了溫度對水稻土壤中產甲烷古菌結構和功能的影響，發現15 ℃和30 ℃時，種群結構發生明顯變化，Methanosarcinacaeae由原來的7%上升到77%（30 ℃）和33%（15 ℃）[30]?；诰W頁的一些工具的開發，大大促進了T-RFLP引物以及限制性內切酶的選擇[31]。如新工具restriction endonuclease picker （REPK） 可以根據研究者提供的不同樣品序列來選擇合適的限制性內切酶，使得基因的選擇可以是多變的，而不是局限于16S rRNA。T-RFLP 應用也越來越廣泛，包括真菌核糖體基因[32]，細菌16S rRNA基因[33]，古菌16S rRNA基因[34]及功能基因如固氮基因[35]、甲烷氧化基因[36]。

2.5實時定量PCR技術

實時定量PCR（real-time quantitative PCR）是基于PCR技術基礎上發展起來的核酸定量技術。實時定量PCR是基于熒光共振能量轉移的原理，在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累對整個PCR進程進行實時監測，最后通過標準曲線對待測未知模板進行定量分析的方法。在實時定量PCR中，CT值是一個重要的參數。研究表明，每個模板的CT值與該模板起始拷貝數的對數存在線性關系。利用已知起始拷貝數的標準品可作出標準曲線，從而只要獲得未知樣品的Ct值，就可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。該技術實現了DNA模板定量的同時，還具有靈敏度高、準確性強、能實現多重反應、無污染性和具實時性等優點。1992年，由Higuchi等首次提出實時定量PCR技術[37]，此后該技術在很多領域廣泛應用。Sawayama等采用實時定量PCR技術對固定床厭氧反應器中固定化產甲烷菌系統發育進行分析，發現大部分固定化產甲烷菌屬于甲烷八疊球菌屬，自由存在的產甲烷菌大部分屬于甲烷八疊球菌屬和甲烷桿菌屬，并成功實現了對固定化與自由存在產甲烷菌的定量分析[38]。Nettmann等利用實時定量PCR結合FISH技術分析了6個不同底物原料農業沼氣罐中產甲烷古菌群落的多樣性，大大豐富了對于大型沼氣反應器中產甲烷古菌的研究[39]。王彥偉等利用實時定量PCR技術結合DGGE研究不同地區低溫沼氣池中前期、后期產甲烷古菌的群落變化情況，結果發現不同樣品發酵前期、后期產甲烷古菌的優勢群落及數量上都存在較明顯的差異[40]。實時定量PCR更能反映出微生物菌群的真實情況并能對目的微生物進行準確定量。

2.6穩定同位素核酸探針技術

穩定同位素核酸探針技術（stable isotope probing，DNA/RNA-SIP）通過對微生物核酸進行同位素標記，從而在分子水平揭示特定元素在復雜環境中的微生物調控機制[41]。根據探測的核酸分子不同可以分為DNA-SIP和RNA-SIP[42]。2000年，Radajewski 等開發了DNA-SIP技術，并成功應用于森林土壤環境中[43]。2002年，Manefield 等利用RNA-SIP技術發現所研究的工業反應器中的苯酚降解菌主要是Thauera genus成員[44]。常用的穩定性同位素有13C 和 15N 等，標記原子增加了DNA的浮力密度，通過密度梯度離心，選擇性回收13C 標記的DNA，可用于微生物的鑒定和代謝功能的分析。除了DNA 之外，RNA 和磷脂脂肪酸（PLFA）等也可被用作標記對象。由于RNA不依賴于細胞分裂，因此標記RNA相較于DNA更接近原位狀況，靈敏度更高。目前穩定性同位素示蹤技術在世界各國學者中掀起研究熱潮。Nikolausz等利用穩定同位素示蹤技術評價不同底物條件下厭氧反應器中主要產甲烷途徑，發現以雞糞為底物的反應器主要通過氫營養途徑產甲烷，而在以玉米飼料和烘干谷物為底物的反應器中，2種產甲烷途徑都存在，同時觀察到在加入玉米飼料后，同位素數值發生了明顯的改變，證實了將同位素示蹤技術用作進程控制的工具是可行的[45]。Conrad等的研究結合了穩定同位素分餾效應和分子生物學技術，評價了不同產甲烷途徑的貢獻率。將穩定性同位素標記技術與分子生物學技術結合而成的穩定性同位素探測技術（SIP），為微生物群落結構、功能結構和代謝功能間關系的建立提供了新的解決方法。

Ginige等以13CH3OH標記的DNA作為模板進行16S rRNA基因序列擴增，發現與甲醇營養菌Methylophilales相關的16S rRNA基因在標記的DNA中具有較高的豐度；同時根據這些序列數據設計FISH探針進行原位雜交試驗，結果表明活性污泥微生物群落的反硝化能力與SIP試驗鑒定到的甲醇營養菌豐度相關；結合顯微放射自顯影技術，認定SIP試驗中所鑒定的甲醇營養菌Methylophilales同時也是活性污泥中重要的反硝化菌[46]。Ginige等很好地證明了多種分子技術復合使用的巨大優勢。然而在實際應用中，由于試驗條件、技術水平等的限制，復合技術聯合使用并未普及，在今后的研究中，復合技術的完善與推廣將成為產甲烷菌多樣性研究的熱點。

3結論

傳統的微生物研究方法是以純培養為基礎的，許多研究證實，通過傳統方法鑒定出來的微生物不到環境微生物總數的10%?；?6S rRNA基因的現代分子生物學技術的出現，給環境微生物的研究提供了更加快速、準確的手段。除了上述列舉的分子生物學技術，還有其他一些技術如單鏈構象多態性（single strain conformation polymorphism，SSCP）分析、實時逆轉錄PCR（real-time RT-PCR）技術等，這些技術各有優勢。在對產甲烷菌多樣性分析中，應注意技術本身的特殊性及存在的不足，采用多種分子技術復合使用，克服操作過程中存在的不確定因素，從而使對復雜系統中產甲烷菌群的結構及代謝途徑的研究更加全面、準確，從而發揮產甲烷菌在環境和能源領域中的重要作用。

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