貢水白柚組織培養快速繁殖技術

石開明　方響亮

摘要：為了探明貢水白柚組織培養快速繁殖高效系統的培養基類型和培養基配方，以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環柚4個品種為材料，研究柚組織培養過程中的關鍵技術。以4種柚成年嫁接樹梢尖、帶芽莖段為外植體，研究柚組織培養各環節的主要影響調控因子，建立有效貢水白柚組織培養快速繁殖體系。結果表明，柚種子發苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養基萌發后，再轉至固體MS培養基上培養為宜；在激素配比中，最適合貢水白柚幼嫩莖段的6-BA濃度為0.5mg/L，NAA濃度以0.2mg/L為佳；不同外植體的培養誘導率表明，用春梢嫩莖段進行組織培養時出芽率高，生長迅速。

關鍵詞：柚；組織培養；快速繁殖

中圖分類號： S666.304+.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0031-03

收稿日期：2014-04-03

基金項目：湖北省教育廳項目（編號：Q20122902）。

作者簡介：石開明（1980—），男，湖北大冶人，博士，講師，主要從事林學園藝植物遺傳育種研究。E-mail：skm331@163.com。

通信作者：方響亮，碩士，實驗師，主要從事野生動物植物保護與利用研究。E-mail：94486529@qq.com。柚子是蕓香科植物柚的成熟果實，柚果實清香、酸甜、涼潤，營養豐富，藥用價值很高，是人們喜食的名貴水果之一。柚果實是柑橘類果實中生長周期最長的品種，采摘期避開了柑果上市“洪峰”，加上柚果大而皮厚，非常適合貯藏，生產上輔以適當保鮮條件和貯藏調控庫的特殊處理，便可周年供應，風味不減，成為柑果類中的“天然罐頭”。

目前，國內柚苗木繁殖技術還相對落后，各種保護技術措施不能得到落實，田間繁殖的柚苗木攜帶有很多病毒和病原體，在推廣過程中容易造成病原傳播，往往使得柚株生長不良，樹勢衰弱，產量減少，品質退化，給柚類生產帶來嚴重影響。植物組織培養技術可以克服傳統苗木繁殖方法易帶毒的不足，同時能獲得基因型統一、表型優良的一致性群體，應用植物組織培養技術對良種柚的苗木進行快速繁殖具有重要的意義。柑橘類組織培養快速繁殖研究，目前以甜橙和寬皮柑橘較多，關于柚的報道較少，一般也都是使用由種子萌發而產生的試管實生苗，并不能解決脫毒問題。在已有的試管苗的組培微繁研究中，涉及到有關不同外植體、上下胚軸、子葉和根尖等不同部位對芽苗分化的影響。目前，我國在研究柚類組培方面的試驗材料已有沙田柚、砧板柚、文旦柚、下河蜜柚、酸柚[1-5]等。通過實生繁殖要克服種子發芽的困難，嫁接無性繁殖用工成本高，不能適應良種柚苗木的快速大量推廣和應用。通過建立一套高速有效組織培養快速繁殖體系，才能克服上述弊端，從而為柚種質資源的基礎研究、生產應用提供一條更好的途徑。本研究分別以4個品種柚消毒的種子、營養器官外植體為材料，研究種子組織培養、激素濃度配比以及不同部位對柚組培快速繁殖的交互影響。

1材料與方法

1.1材料

柚組織培養快速繁殖系統的建立以沙田柚、蜜柚、紅心柚、玉環柚成熟種子為試材。取成年柚子樹上嫩葉、嫩莖尖、帶芽莖段為外植體。柚嫁接樹外植體組織培養供試品種取材為已掛果的5年生蜜柚、紅心柚、沙田柚和玉環柚，取其梢尖、帶芽莖段為外植體。沙田柚由湖北民族學院柚子園提供，蜜柚、玉環柚、紅心柚由湖北省恩施市巴東縣園藝場提供。

1.2培養基

1.2.1種子培養以MS和1/2MS培養基培養各品種柚成熟和未成熟種子。

1.2.2不同激素濃度誘導不定芽以MS培養基為基礎，添加不同濃度6-BA和NAA，具體培養基組成見表1。

表1培養基激素濃度

序號激素濃度（mg/L）6-BANAA100.2200.5301.040.50.250.50.560.51.071.00.281.00.591.01.0

1.2.3不同外植體培養柚外植體的培養參見鄒金美等的方法[4]，在MS培養基上輔以0.5 mg/L 6-BA，0.2 mg/L NAA。4個品種柚莖尖、莖段各設40個外植體處理，在組織培養條件下進行不定芽誘導。

1.3材料消毒

研究培養條件為白天25 ℃，夜晚18 ℃；光照強度1 000～2 000 lx；光暗周期16 h/8 h；相對濕度80%。瓊脂用量為 6.0 g/L，培養基pH值5.8。相關化學試劑的配制：75%的乙醇、0.1%氯化汞、蒸餾水、MS培養基、1/2MS培養基。莖尖消毒：一般先取較大的莖尖，表面消毒后，再在無菌條件下借助解剖顯微鏡取出所需大小的莖尖培養。莖尖表面消毒：從柚母株上剪下帶萌動的飽滿芽嫩莖，作為外植體。先用蒸餾水浸泡3 min，再用流水沖洗30 min，用6%NaClO漂洗 10 min，然后轉入超凈工作臺，用等體積75%乙醇浸泡30 s，無菌水沖洗3次后，用0.1%L氯化汞滅菌10 min。剝取生長點，切取莖尖頂端1.5 mm分生組織，轉入無菌培養皿內，無菌濾紙吸干水，接種至MS培養基上進行培養。莖尖的剝離：在剝取莖尖時，把莖芽置于解剖鏡下，1只手用鑷子將其按住，另1只手用解剖針將葉片和葉原基剝掉，解剖針蘸入90%乙醇并用火焰灼燒進行消毒。用解剖刀片切取分生組織時宜帶1～2張幼葉，接種微莖尖時確保不與其他物體接觸，只用解剖針接種即可。剝離莖尖時，應盡快接種，防止莖尖變干。莖段消毒：取健壯無病蟲的幼嫩莖，去葉片剪成3～4 cm小段。在自來水中沖洗1～3 h，用75%乙醇滅菌30～60 s，再用0.1%氯化汞泡25 min，最后用無菌水沖洗4～5次后接種。取材時優先利用頂部的外植體，其次也可利用腋芽，取莖上部的腋芽培養效果較好。

2結果與分析

2.1不同品種柚種子培養條件對種子萌發的影響

在固體和半固體的MS、1/2MS培養基上接種不同品種柚的成熟與未成熟種子做對比，試驗結果見表2。固體1/2MS培養基是常用于種子萌發的培養基。柚子在種子萌發階段，種子在半固體培養基中比在固體培養基中更容易啟動萌發，這可能與半固體培養基有更好的流動性有關，使營養成分能與種子充分的接觸，更容易充分吸收營養的MS培養基作為組培常用的培養基，萌發出的無菌苗比l/2MS培養基上萌發的無菌苗更粗壯，這可能與MS培養基含有較高的無機元素有關。發苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養基上萌發后，轉至固體MS培養基上培養。表2不同培養條件對種子萌發的影響

試驗號培養基培養基狀態種子類型品種萌發率（%）生長情況1MS固體成熟沙田柚78.0bc萌發晚，生長良好2MS固體成熟蜜柚67.0c萌發較早，部分黃化3MS固體成熟紅心柚86.6ab萌發早，生長良好4MS固體成熟玉環柚72.0a萌發較早，生長較好5MS半固體未成熟沙田柚82.0ab萌發早，生長良好6MS半固體未成熟蜜柚76.0bc萌發早，生長緩慢7MS半固體未成熟紅心柚81.3b萌發早，生長較好8MS半固體未成熟玉環柚78.0bc萌發早，生長緩慢91/2MS固體未成熟沙田柚88.0ab萌發較晚，幼苗較瘦弱101/2MS固體未成熟蜜柚96.0a萌發早，幼苗黃化、瘦弱111/2MS固體未成熟紅心柚84.3b萌發較晚，幼苗較瘦弱121/2MS固體未成熟玉環柚85.2b萌發較晚，幼苗瘦弱131/2MS半固體成熟沙田柚89.0ab萌發較早，幼苗瘦弱141/2MS半固體成熟蜜柚90.0a萌發較晚，幼苗瘦弱151/2MS半固體成熟紅心柚92.4a萌發較早，幼苗瘦弱161/2MS半固體成熟玉環柚91.4a萌發較晚，幼苗瘦弱注：同列數據后不同小寫字母表示差異顯著（P<0.05）。表3、表4同。

2.2不同激素組合對誘導不定芽的影響

不同激素濃度組合對幼嫩莖段誘導不定芽的影響見表3。當培養基中6-BA和NAA的濃度搭配處于較低范圍時，對外植體的出芽誘導影響不明顯；隨著激素濃度提高，外植體的誘導成活率卻有一定程度降低，激素濃度為最大組合 1.0 mg/L 6-BA、1.0 mg/L NAA時，外植體的芽誘導率為275%～30.0%。結果表明，在未添加激素的基本MS培養基中，出芽誘導率很低，為3.1%～4.8%，觀察到出芽的基本是由腋芽分化形成，未有通過不定芽誘導出芽的；在低濃度范圍內，隨著6-BA濃度的上升，出芽率也隨之提高，當6-BA增加到0.5 mg/L、NAA濃度為0.2 mg/L時，誘導出芽率達到90%以上，當增加至10 mg/L時，出芽率下降至30%左右；單獨分析NAA的影響可知，當添加1種激素NAA時，40個外植體最多誘導產生42個不定芽，誘導分化率很低，只有搭配合適的6-BA和NAA配比才能有效促進不定芽的誘導和分化。結果表明，在基本培養基上添加2種激素的最佳組配濃度為0.5 mg/L 6-BA、0.2 mg/L NAA時，誘導效果與其他處理間差異明顯。表3不同激素組合對幼嫩莖段誘導不定芽的影響

激素（mg/L）6-BANAA蜜柚沙田柚紅心柚玉環柚出芽率（%）總芽數（個）出芽率（%）總芽數（個）出芽率（%）總芽數（個）出芽率（%）總芽數（個）00.24.1d24.8d13.5d03.1d100.537.5bc3931.5bc2228.1bc3035.5bc3001.047.5b3847.5b3436.5b4255.5b380.50.290.0a9892.5a12292.0a11191.0a1100.50.587.5a10977.5a12775.5a12976.0a740.51.042.5b6555.0b7557.0b7350.0b721.00.237.5bc4142.5bc4340.5bc4439.5bc421.00.530.0bc3435.0bc3333.5bc3534.0bc331.01.027.5bc2830.0bc3128.5bc3029.5bc32

2.3不同外植體的培養對不定芽發生的影響

通過對4個品種柚莖尖和莖段的外植體進行培養，研究對不定芽產生的影響，試驗結果見表4。通過前部分建立的柚最優體系培養的研究結果看出，各種類柚均能有效誘導出芽，出芽率均在80%以上，誘導形成的芽叢生且生長勢強；不同外植體不同取材部位對誘導出芽率有較大影響，莖段最高的達950%，高于莖尖最高的87.5%，一般情況下，莖段可誘導形成3～4個叢生不定芽，莖尖則只有2～3個，有明顯的差距。

表4不同外植體對不定芽發生的影響

品種外植體

部位外植體

數量（個）形成芽出芽外植

體數（個）不定芽誘

導率（%）芽生長

情況出芽所需

時間（d）沙田柚莖段403895.0a叢生20蜜柚莖段403485.0b叢生24紅心柚莖段403690.0a叢生23玉環柚莖段403485.0b叢生22沙田柚莖尖403587.5ab叢生15蜜柚莖尖403280.0c叢生17紅心柚莖尖403485.0b叢生18玉環柚莖尖403382.5bc叢生16

3結論與討論

本研究通過對柚種子萌發條件、培養基激素組合以及不同外植體誘導的對比，研究貢水白柚組織培養各環節的主要影響調控因子，以期建立有效貢水白柚組織培養快速繁殖體系。結果表明，柚種子發苗的最佳方案是成熟種子在半固體1/2MS培養基上萌發后，再轉至固體MS培養基上培養為宜；在激素配比中，最適合貢水白柚幼嫩莖段的6-BA濃度為0.5 mg/L，NAA濃度以0.2 mg/L為佳；不同外植體培養誘導率表明，春梢嫩莖段組織培養時出芽率高，生長迅速，可能與春梢外植體內含大量促進細胞生長分裂的激素和其他某些促進生長的調節物質有關。

相同品種不同取材部位外植體的再生能力不同，各品種柚莖段直接出芽能力均高于莖尖。相關研究表明，最初來自根段的莖尖外植體發生側枝的數量和發生根的數量、長度、干質量及鮮質量都高于來自莖段的莖外植體和側芽外植體[6-7]。本試驗對柚莖段、莖尖外植體直接出芽能力作了分析，結果表明，2份品種均以莖段直接出芽能力最高，有利于快速繁殖和培養，從遠離基部的表面誘導出芽苗的數目較多。

在離體繁殖時，多年生木本植物選擇外植體的取材時期非常重要。耿文娟等研究表明，野生歐洲李組織培養時以5～6月的半年生枝梢為材料效果最好[8]。本研究中進行組織培養的柚外植體主要取自發育成熟的春梢和部分早秋梢，時間因物候期稍有差異，本試驗結果基本與前人研究結果一致?？赡芘c新梢自身的發育狀況有關，也可能與新梢發育過程中隨季節變化體內內源激素種類、含量的變化有關。

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