與家蠶絲氨酸蛋白酶抑制劑serpin—3相互作用蛋白的篩選

王明慧　毛鈺霞　許雅香

摘要：絲氨酸蛋白酶抑制劑超基因蛋白質家族，參與調節昆蟲體內多種生理反應。本研究在體外原核表達 6His-Bmserpin-3，以此作為餌蛋白，采用His-pull down技術及SDS-PAGE分析，從家蠶血液中篩選出了能與 Bmserpin-3 結合的2個蛋白質，分子量分別為83.04、83.57 ku。對家蠶幼蟲sp-2、sp-3在不同組織的表達變化分析可知，sp-2 在脂肪體、血淋巴中表達量比較高，sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴里表達量比較高。

關鍵詞：家蠶；pull-down；蛋白相互作用

中圖分類號： S881.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0037-03

收稿日期：2014-03-03

基金項目：現代農業產業技術體系建設專項（編號：CARS-22）；江蘇高校優勢學科建設工程項目。

作者簡介：王明慧（1986—），女，山東濱州人，碩士，主要從事家蠶資源與功能基因組學研究。E-mail：wangminghui.219@163.com。

通信作者：許雅香，副教授，主要從事家蠶資源與功能基因組學研究。Tel：（0512）65880260；E-mail：xuyaxiang@suda.edu.cn。Serpin全稱為serine protease inhibitor，是一類能夠抑制絲氨酸蛋白酶活性的超家族蛋白質，參與調節生物體內多種生理反應，包括血液凝集、纖維蛋白溶解、補體激活、免疫黑化、生長發育過程中組織構建等[1-5]。Serpin在昆蟲各組織中均有分布，對昆蟲的生命活動起到重要作用，目前關于家蠶Serpin的研究很多，但是幾乎沒有關于家蠶Serpin相互作用蛋白方面的研究，生物的生命活動主要體現在蛋白質水平，許多蛋白是通過與其他蛋白相互作用來發揮作用的，因此，研究蛋白質相互作用能更好地理解生物的生命活動。本研究原核表達并純化了Bmserpin-3蛋白，應用pull-down及質譜技術篩選到Bmserpin-3的相互作用蛋白，并通過熒光定量PCR技術初步探索了這2個基因的組織分布，旨在為深入探討 Bmserpin-3 的功能機制提供依據。

1材料與方法

1.1材料

家蠶品種為筆者所在研究室保存的大造，正常桑葉育，取5齡4 d幼蟲的脂肪體，-70 ℃保存備用。Trizol RNA提取及M-MLV反轉錄試劑等化學常規試劑均購自寶生物工程（大連）有限公司。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2重組表達載體的構建和鑒定

采用反轉錄的家蠶5齡4 d幼蟲脂肪體的cDNA模板，PCR擴增serpin-3基因。引物為F：5′-CTAGCTAGCAACATAGATCCGAACACCCTAAG-3′（下劃線為NheⅠ酶切位點）和R：5′-ACGCGTCGACCTATAGTACTTTATAATCCCCATCG-3′（下劃線為SalⅠ酶切位點）。擴增條件是：95 ℃ 預變性 3 min；95 ℃變性30 s，60.4 ℃退火35 s，72 ℃延伸3 min，33個循環；最后72 ℃終延伸10 min。將PCR擴增產物與pET-28a（+）進行雙酶切，然后再將其目的片段與 pET-28a（+） 連接，轉化至E.coli Top10中，挑選陽性克隆進行酶切鑒定及測序檢驗。

1.3重組表達載體的誘導表達

含家蠶serpin-3全長cDNA的陽性菌株在含30 mg/L卡那霉素的LB培養基中加入誘導劑異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃誘導表達6 h后，4 ℃ 5 000 r/min離心10 min收集菌體，用PBS重懸，在冰浴中超聲破碎，直到溶液變澄清。4 ℃ 5 000 r/min離心 10 min，收集沉淀即得包涵體形式的6His-Bmserpin-3。

1.4重組蛋白的純化、鑒定

4 ℃ 5 000 r/min離心20 min收集細胞，以1 ∶20比例添加0.01 mol/L PBS （pH值為 8.0），在PBS中懸浮細胞，冰上超聲后添加等量的蛋白loading buffer，蛋白樣品煮沸5 min，5 000 r/min 離心20 min。上清通過SDS-PAGE（沒有梳子）來純化，鋅染后，將膠條切成1 cm的條帶，裝到透析袋里，4 ℃ 透析過夜。用Brandford法檢測蛋白含量后，-20 ℃保存備用，將純化好的蛋白用SDS-PAGE來鑒定。

1.5pull-down篩選與Bmserpin-3重組蛋白相互作用蛋白

按照每100 mg組織加入1 mL裂解液的比例加入RIPA裂解液（使用前數分鐘加入PMSF使PMSF終濃度為1 mmol/L），通過強烈的渦旋使樣品裂解充分，5 000 r/min離心5 min，取上清，儲存于-20 ℃冰箱中備用。用10 mL binding buffer 平衡250 μL樹脂，將純化后的Bmserpin-3蛋白與樹脂在4 ℃下緩慢搖晃結合5 h，使Bmserpin-3蛋白與樹脂充分結合，讓蛋白液流出，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫Ni2+柱，祛除未結合的Bmserpin-3蛋白，將1 mL血液總蛋白加入Ni2+柱中，與Bmserpin-3蛋白復合物共同4 ℃孵育過夜，使血液內靶蛋白與Bmserpin-3蛋白結合，從而形成樹脂-Bmserpin3-血液總蛋白的復合物，用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫Ni2+柱，祛除未結合的血液總蛋白，用含 200 mmol/L 咪唑的 elution buffer洗脫液，將Bmserpin3-血液總蛋白復合物與樹脂分離，收集洗脫液，12% SDS-PAGE分析收集的洗脫液。

1.6靶標蛋白基因的分布

采用Primer 5.0軟件，引物如表1所示。采用SYBR PrimeScriptTM RT-PCR試劑盒測定，具體步驟按照說明書進行，反應程序為：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火 30 s，循環45次。反應體系為：SYBRPremix Ex TaqTM（2×） 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye Ⅱ（50×） 0.4 μL，DNA模板 2 μL，ddH2O 6.8 μL。反應過程由ABI7300熒光定量PCR儀（Applied Biosystems公司）軟件自動設定，每個樣品重復3次。表1實時熒光定量PCR的檢測基因、內參照基因的引物

基因名稱引物序列Tm（℃）Actin3F：5′-CGGCTACTCGTTCACTACC-3′；R：5′-CCGTCGGGAAGTTCGTAAG-3′59.27Bmsp-2F：5′-TTAATTCTGGCTGGGCTTGT-3′；R：5′-TTAGTTGGCTCACATCTTGG-3′ 55.80Bmsp-3F：5′-GATTTTAGCGGGGCTTATTG-3′；R：5′-AGTCCTGGGCGACTTTGTAG-3′ 55.80

2結果與分析

2.1重組表達載體的構建與鑒定

含有酶切位點NheⅠ、SalⅠ的引物擴增serpin-3基因的ORF，得到1 300 bp左右的條帶，PCR純化的目的片段與 pET-28a（+）連接后，轉化至E.coli Top10中，挑選陽性克隆進行酶切鑒定（圖1），條帶約1 300 bp，表明重組質粒構建成功，命名為pET-28a-Bmserpin-3。

2.2重組蛋白的純化與鑒定

重組質粒轉化至E.coli BL21，經IPTG誘導表達重組 Bmserpin-3 蛋白，表達的蛋白多是以包涵體方式存在，用鋅染、透析的方式進行純化，結果如圖2所示，SDS檢測到1條單一的約49 ku的蛋白條帶。

2.3重組蛋白相互作用蛋白的鑒定

樣品組內形成樹脂-Bmserpin-3-血液總蛋白的復合物后，先用含50 mmol/L咪唑的Tris洗脫，祛除非特異性結合，然后用含200 mmol/L咪唑的elution buffer洗脫液使 Bmserpin-3-血液總蛋白復合物與樹脂分離，收集樣品，后期用SDS-PAGE分析（圖3）?？梢娕cBmserpin-3相互作用的3條蛋白條帶。從SDS-PAGE膠上將3條蛋白條帶切下，放入EP管中，加入胰蛋白酶進行膠內酶切，然后用LC-MS/MS技術對獲得的3條蛋白條帶進行分析（圖4）。鑒定出的蛋白是家蠶儲存蛋白、性別特異儲存蛋白2，相關蛋白信息見表2。

2.4家蠶幼蟲Bmsp-2，3在不同組織的表達變化

由圖5可以看出，sp-2、sp-3在各個組織都有分布，且sp-2在脂肪體、血淋巴中表達量比較高；sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴中表達量比較高。

4結論與討論

蛋白質是生物生命活動的重要體現者之一，幾乎參與生物所有的生命過程、細胞活動。它在體內主要通過與自身或其他蛋白質及核酸形成復合體來進行基因調節、免疫應答、信

表2相互作用蛋白相關信息

蛋白質名稱基因登錄號得分等電點分子量

（ku）性別特異儲存蛋白2gi|1244307251015.7083.57家蠶儲存蛋白gi|3793278111785.9083.04

號轉導、細胞組裝等生物學功能[6-7]。通過研究蛋白質之間的相互作用可獲得更多的細胞功能信息。目前蛋白質相互作用的主要研究方法有酵母雙雜交技術、免疫共沉淀法、噬菌體展示技術、pull-down技術、熒光共振能量轉移（FRET）技術及生物信息學分析法等。已有學者利用pull-down 方法鑒定已知的2種蛋白質間的相互作用，或采用少量Ni2+-NTA agarose beads 在Eppendorf 管中進行小體積的pull-down[8-9]。筆者采用Ni2+-NTA agarose beads 柱使整個體系放大，更利于蛋白質的結合、洗脫，并結合質譜分析來篩選與Bmserpin-3相互作用的蛋白質。絲氨酸蛋白酶抑制劑在生物體內分布廣泛，參與調節生物體內多種生理反應。研究發現，云杉卷葉蛾serpin-1在表皮中高表達，且在蛻皮期間的轉錄水平高于蛻皮期。煙草天蛾serpin-1mRNA在5齡幼蟲脂肪體中含量豐富，但在蛻皮、化蛹時mRNA水平驟然降低[10]。岡比亞按蚊serpin-2與絲氨酸蛋白酶CLIPB9結合調節黑化反應，此外CLIPB9與serpin2的相互作用還影響雌性成蟲壽命[11]。果蠅serpin27A與serpin28D都參與了先天性免疫反應，但果蠅serpin28D只參與由創傷引起的酚氧化酶激活產生的黑化，serpin27A在酚氧化酶激活路徑中調節病毒或病原菌引起的黑化[12-13]。果蠅中serpin43AC參與了toll途徑調節的先天性免疫反應[14-15]。研究發現，岡比亞按蚊中serpin10在中腸上皮細胞聚集與瘧疾病原體的傳播有關[16]。Serpin家族在昆蟲的表皮、頭部、血淋巴、脂肪體、絲腺、中腸、精巢、卵巢中均有分布，對家蠶的各種生理活動起到調節作用[17]。董照明等認為，serpin-16在維持絲腺穩定的泌絲環境中發揮重要作用[18]。查宏賢研究表明，家蠶serpin-4參與了先天性免疫反應[19]。王彥云等證實serpin-6與家蠶表皮黑化、蛻皮變態、先天性免疫等生理過程有關[20]。李國勝等推測serpin-5與家蠶的生殖生理有關，可能參加了家蠶的先天免疫反應[21]。serpin-3是以單體的形式發揮作用還是與伴侶分子一起作用或是與其他蛋白質形成復合物來發揮作用還不得而知。本研究選擇適宜大分子量蛋白質的六聚組氨酸作為標簽，構建了家蠶serpin-3六聚組氨酸蛋白，并以此為餌蛋白，采用His-pull down技術，從家蠶血液中調取了2個與該蛋白相互作用的蛋白。它們均是血液儲存蛋白，同源性很高，與β-芳基儲存蛋白亞基（煙草天蛾）、芳基儲存蛋白（棉鈴蟲）、血清儲存蛋白2（印度蠶）具有很高的同源性，功能也相似，主要是參與免疫、信號傳導。對家蠶幼蟲sp-2、sp-3在不同組織的表達變化分析可知，sp-2在脂肪體、血淋巴中表達量比較高，sp-3在精巢、脂肪體、血淋巴里表達量比較高。

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