康氏木霉內切β—葡聚糖苷酶的分離純化及酶學性質

覃益民　張靜茹　葉錦+　等

摘要：康氏木霉GIMP3.444經搖瓶發酵，獲得分泌到胞外的纖維素酶，粗酶液經（NH4）2SO4分級沉淀、Sephacryl S200凝膠過濾層析、DEAE Sepharose FF離子交換層析及Octrl Separose CL-4B疏水層析分離純化出一種內切型的β-葡聚糖苷酶，SDS-PAGE電泳鑒定為單一條帶，BIO-RAD分析相對分子量為61.8 ku。 該內切β-葡聚糖苷酶的最適反應溫度為55 ℃，最適反應pH值為4.4，作用于羧甲基纖維素鈉時，Lineweaver-Burk法求得Km、Vmax分別為481 mg/mL、2.48 mg/（min·mL）。

關鍵詞：康氏木霉；內切β-葡聚糖苷酶；分離純化；酶學性質

中圖分類號： Q556+.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）01-0040-04

收稿日期：2014-03-27

項目基金：國家自然科學基金（編號：21276053）；廣西壯族自治區生物煉制重點實驗室培育基地開放課題（編號：GXBF11-04）。

作者簡介：覃益民（1962—），男，廣西貴港人，博士，副教授，主要從事生物加工與分離方面的研究。Tel：（0771）3233718；E-mail： qym6289@sina.com。植物纖維由纖維素、半纖維素和木質素三大部分組成并共同構成了植物細胞壁的主要成分，是最豐富的天然可再生生物資源，纖維素通過纖維素酶水解轉化為可發酵性糖，繼而轉化為燃料乙醇及相關化學品的研究越來越引起人們的關注[1]。纖維素酶是一類能夠將纖維素降解為葡萄糖的多組分酶系的總稱，由內切β-葡聚糖苷酶 （EG） 、 外切β-葡聚糖苷酶 （CBH）和 β- 葡萄糖苷酶 3 類酶組成。盡管大量研究已表明，只有在這3種主要成分酶的協同作用下，纖維素分子最終才能被降解成葡萄糖。但是各成分酶是如何協同起作用的，學者們的看法還不盡相同[2]，近來人們還發現了一些不具有纖維素酶活性的蛋白也能與纖維素酶起協同作用，并最終促進纖維素的降解[3-5]。因此，無論是對纖維素酶系各成分酶的協同作用機理，還是對纖維素酶系與其他非酶蛋白的協同增效作用的更深入了解，都將會為提高纖維素酶的催化效率提供重要理論基礎?？凳夏久笹IMP 3.444是一株產纖維素酶系的真菌菌株[6]，筆者從該菌株中分離純化出一種纖維素酶協同增效蛋白。為進一步研究該增效蛋白對纖維素酶各成分酶的協同作用機理，需獲得該菌株產的纖維素酶系各組分純酶。因此，本研究對康氏木霉GIMP3.444分泌的內切β-葡聚糖苷酶進行分離純化，并研究其酶學性質。

1材料與方法

1.1菌株

康氏木霉（Trichoderma koningii）GIMP 3.444購于廣東省微生物菌種保藏中心，現保存于廣西大學化學化工學院生物化工實驗室。

1.2培養基和試劑

（1）斜面活化培養基：200.0 g馬鈴薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O、20.0 g 瓊脂粉，加自來水至1 000 mL，調 pH值至 6.0，121 ℃滅菌 20 m in。（2）搖瓶種子培養基：200.0 g 馬鈴薯、20.0 g 葡萄糖、30 g KH2PO4、1.5 g MgSO4·7H2O，加自來水至1 000 mL，調pH值至 6.0，121 ℃滅菌 20 m in。（3）液體發酵培養基：15.0 g 甘蔗渣（過80目篩）、8.0 g 麥麩粉、4.0 g （NH4）2SO4 、3.0 g KH2PO4 、1.5 g MgSO4·7H2O，加自來水至1 000 mL，調pH值至6.0，121 ℃滅菌 20 min。（4）DNS試劑：稱取6.3 g 3，5-二硝基水楊酸、20.96 g NaOH、182.0 g酒石酸鉀鈉、5.0 g苯酚、5.0 g 亞硫酸鈉，分別用去離子水溶解后混合，待混合液冷卻至室溫定容至 1 000 mL。保存在棕色瓶中，在室溫下放置 7 d 即可使用。（5）考馬斯亮藍G-250溶液：稱取考馬斯亮藍G-250 100 mg，溶于50 mL 95%乙醇中，再加入100 mL 85%磷酸，混合均勻后用去離子水定容至1 000 mL。

1.3菌種的培養

取保存的康氏木霉接種于斜面活化培養基，28 ℃條件下活化培養3～7 d，刮取平面孢子，用無菌水制成孢子懸浮液，按1%體積比（V/V）接種至種子培養液中，于180 r/min、28 ℃下培養30～36 h。將搖瓶種子按5%體積比（V/V）接種量接種至裝有150 mL發酵培養基的500 mL三角瓶中，于 180 r/min、28 ℃下培養120 h。

1.4內切β-葡聚糖苷酶的分離純化

1.4.1發酵液的預處理取“1.3”節培養好的發酵液，用4層紗布過濾，在4 ℃、6 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，用截留分子量為10 000 Da的VIVAFLOW 200平板超濾膜濃縮20倍左右，得到粗酶液。粗酶液先用20%飽和度的硫酸銨沉淀，4 ℃下靜置過夜；6 000 r/min離心20 min，取上清液繼續加入硫酸銨至飽和度為80%，4 ℃下靜置過夜；離心得沉淀，用0.05 mol/L pH值7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液復溶，再次離心后，去除不溶物，復溶酶液4 ℃冰箱保存。

1.4.2Sephacryl S-200凝膠過濾層析取2.0 mL的鹽析復溶液，上樣于Sephacryl S-200 HR凝膠過濾柱（10 mm×700 mm）中，用0.05 mol/L pH值 7.0的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液（含NaCl 0.2 mol/L）洗脫，用自動收集器按 2.0 mL/（管·10 min） 收集組分，測定每管內切β-葡聚糖酶活力，收集有內切β- 葡聚糖酶活性洗脫峰，4 ℃保存備用。

1.4.3DEAE Sepharose FF離子交換層析取“1.4.2”節收集的蛋白樣，用VIVAFLOW 50平板超濾膜濃縮，并用 0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至DEAE Sepharose FF陰離子交換柱（16 mm×200 mm）中，0～0.8 mol/L NaCl濃度梯度洗脫，自動收集器 5 mL/（管·5min） 收集組分，測定各峰的內切β-葡聚糖酶活力，收集內切β- 葡聚糖酶活性峰，4 ℃條件保存備用。

1.4.4Octrl Separose CL-4B疏水層析取“1.4.3”節中收集的內切β-葡聚糖酶活性峰，超濾濃縮并用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L的0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至Octrl Separose CL-4B疏水層析柱（10 mm×400 mm）中，2.0～0 mol/L （NH4）2SO4 濃度梯度洗脫，自動收集器3 mL/（管·10 min） 收集組分，測定各峰的內切β- 葡聚糖酶活力，收集內切β-葡聚糖酶活性峰，4 ℃條件保存備用。

1.5測定方法

1.5.1蛋白濃度的測定以牛血清白蛋白為標準，用考馬斯亮藍G-250法[7]測蛋白液濃度。

1.5.2內切β-葡聚糖苷酶活力（EG）測定采用DNS法[8]測定內切酶活性。向試管中加入1.5 mL 10 g/L的羧甲基纖維素鈉檸檬酸-檸檬酸鈉溶液（0.1 mol/L，pH值 4.8）及 0.5 mL 酶液，50 ℃水浴中保溫30 min，取出后加入 3.0 mL DNS試劑終止反應，沸水浴5 min，取出流水冷卻，定容至 25 mL，在540 nm波長處測定吸光度。以每分鐘催化底物生成1 μmol葡萄糖所需的酶量定義為一個活力單位，單位用IU/mL表示。

1.5.3蛋白質純度鑒定及相對分子量測定采用SDS-PAGE法[9]。聚丙烯酰胺凝膠質量分數為12%，蛋白標準品的分子質量范圍1.44×104～9.74×104 ku。

1.5.4最適反應溫度測定將純酶稀釋后，在pH值 4.8條件下，于不同溫度（25 ℃～80 ℃）水浴中與底物保溫30 min，測定內切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，確定酶的最適反應溫度。

1.5.5最適反應pH值測定分別用不同pH值（2.6～8.0）的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配置1%的羧甲基纖維素鈉懸浮液，作為不同pH值條件下的酶作用底物，加入用相應pH值緩沖液稀釋的純酶，在50 ℃水浴中保溫30 min，測定不同pH值下的內切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，確定酶的最適反應溫度。

1.5.6底物動力學參數測定分別配置濃度為0.1%、015%、0.2%、0.25%、0.3%、0.35%的羧甲基纖維素鈉懸浮液（pH值 4.8），加入適當稀釋純酶液，在50 ℃水浴中保溫30 min，DNS法測定各不同濃度底物時產生的還原糖，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數作圖法[10]作圖，計算出該酶作用于羧甲基纖維素鈉時的Km值和Vmax值。

2結果與分析

2.1內切β-葡聚糖苷酶的分離純化及分析

康氏木霉發酵液經20～80%硫酸銨分級沉淀，上樣至Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析柱，洗脫流速為 0.2 mL/min，洗脫結果如圖1所示，共有3個蛋白峰。酶活測定發現第3個蛋白峰沒有纖維素酶活性，為雜蛋白，而峰Ⅰ、峰Ⅱ均具有較高的內切β-葡聚糖苷酶活性，說明康氏木霉的發酵液中至少含有2種內切酶。本研究僅介紹對第1個蛋白峰的分離純化。

收集圖1中的峰Ⅰ蛋白，超濾法濃縮并進行緩沖液置換后，上樣至用0.05 mol/L pH值 7.0磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液平衡的DEAE Sepharose FF離子交換層析柱，分別用3倍柱體積的含NaCl 0.1、0.2、0.3、0.8 mol/L的緩沖液進行洗脫，流速為1.0 mL/min，結果如圖2所示，共有5個蛋白吸收峰，經測定內切酶活主要集中在峰3中。

合并圖2峰3蛋白，超濾濃縮用含（NH4）2SO4 2.0 mol/L 的磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液置換，上樣至平衡的Octrl Separose CL-4B疏水層析柱，分別用3倍柱體積的含 1.0 mol/L （NH4）2SO4緩沖液和無（NH4）2SO4的緩沖液洗脫，流速為0.3 mL/min，如圖3所示，得到3個蛋白峰，經酶活測定，發現只有第3個峰具有內切酶活性（圖中記為EG）。

取經硫酸銨分級沉淀、Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析、DEAE Sepharose FF離子交換層析、Octrl Separose CL-4B疏水層析純化的內切β- 葡聚糖酶進行SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果見圖4。圖4表明，通過以上4步純化過程，內切β-葡聚糖酶的純度逐步提高，且經疏水層析后的酶組分在SDS-PAGE電泳膠上顯示為單一條帶，表明該組分已達電泳純，凝膠成像系統分析內切β-葡聚糖酶的相對分子量約為61.8 ku，比文獻[11-14]報道的康氏木霉內切葡聚糖酶大，也偏大于里氏木霉[15-16]內切葡聚糖酶，而與綠色木霉[17]和擬康氏木霉[18]中的內切葡聚糖酶相近。

內切β-葡聚糖酶的分離純化過程如表1。表1表明硫酸銨分級沉淀除去了部分的非酶雜蛋白，純度提高了132倍。而Sephacryl S-200 HR凝膠過濾層析對內切β-葡聚糖

酶的提純效果不太理想，在鹽析的基礎上內切酶只被純化了1.34倍，這是因為在鹽析樣中有多種內切酶共存，此時測得的內切酶活力會高于凝膠過濾層析后得到的內切β- 葡聚糖酶活力。DEAE Sepharose FF離子交換層析也能去除較多的雜蛋白和多糖物質，內切β-葡聚糖酶的比活力達到 983 IU/mL，純化了2.98倍。經過Octrl Separose CL-4B疏水層析，內切葡聚糖酶最終達到電泳純，此時比活力為 24.91 IU/mg，與粗酶液相比，提高了7.55倍，回收率為3.72%。

表1康氏木霉內切β- 葡聚糖酶的分離純化

純化過程總蛋白

（mg）總活力

（IU）比活力

（IU/mg）回收率

（%）純化

倍數粗酶液496.721 639.183.30100.001.0020%～80%（NH4）2SO4 332.801 451.014.3688.521.32Sephacryl S-200 HR162.93953.145.8558.151.77DEAE Sepharose FF 24.82243.989.8314.882.98Octrl Separose CL-4B 2.4561.0324.913.727.55

2.2內切β-葡聚糖苷酶的酶學性質

2.2.1內切酶的最適反應溫度為了測定反應溫度對內切β-葡聚糖苷酶活性的影響，確定酶的最適反應溫度，在同一pH值條件下，分別測定不同反應溫度時的酶活力，以最大酶活力為100%，計算相對酶活力，結果如圖5。圖5表明，在 25～55 ℃ 范圍內，內切酶活力隨著溫度升高而增加，在55 ℃時酶活力最大，說明內切酶的最適反應溫度為55 ℃；溫度繼續升高，內切酶活力逐漸降低，80 ℃時，酶活力僅有最高活力的16.3%。在55～75 ℃范圍內，酶活力隨溫度升高而降低的斜率的絕對值大于低溫范圍內酶活力隨著溫度升高而增加的斜率，說明該內切酶對高溫更敏感。

2.2.2內切酶的最適反應pH值用不同pH值的緩沖液配置酶反應底物，測定pH值對內切β-葡聚糖苷酶活性的影響，以確定酶的最適反應pH值，分別將該酶與上述底物在 50 ℃ 條件下反應，測定內切β-葡聚糖苷酶活力，以最大酶活力為100%，計算相對酶活力，結果如圖6?？梢?，當pH值小于4.4時，內切酶活力隨著pH值的增大而增加，至pH值 4.4時酶活力達最大值，故該內切酶的最適最適pH值為44；pH值 4.4～8.0范圍內，內切酶活力隨著pH值的繼續增大而降低，但在pH值為6.2時，酶活力仍有最大值的758%，這可能是因為該內切酶在pH值 4.4～6.2之間活性較穩定。

2.2.3內切酶的底物動力學性質將稀釋的純酶液分別與不同濃度底物反應，測定生成的還原糖量，然后按照Lineweaver-Burk雙倒數作圖法作圖，結果如圖7?；貧w得出標準方程為1/v=1.942 1（1/[S]）+0.403 9，求得以羧甲基纖維素鈉為底物時，內切β-葡聚糖苷酶的Km值為 4.81 mg/mL，Vmax值為2.48 mg/（min·mL）。

3結論

本研究從康氏木霉液態搖瓶發酵液中分離純化得到一種電泳純的內切β-葡聚糖苷酶，比活力為24.91 IU/mg，相對分子量為61.8 ku。酶學性質測定結果顯示，純化的內切β-葡聚糖苷酶無外切β-葡聚糖苷酶及β- 葡萄糖苷酶活性，作用于羧甲基纖維素鈉時，Km為4.81 mg/mL，Vmax為 2.48 mg/（min·mL），最適反應溫度為55 ℃，最適反應pH值為4.4，可用來分析纖維素酶系蛋白之間的協同水解作用。

本研究結果還表明，康氏木霉分泌的內切β-葡聚糖苷酶不止一種，因此，在研究纖維素酶系各成分酶的協同作用機理或研究纖維素酶系與其他非酶蛋白的協同增效作用時，須考慮同功酶存在的影響。

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