他莫昔芬對牙髓干細胞體外分化的影響

王 娟，劉寶剛，馬逢樂，何欣遙，王志華，何文喜

（1．軍事口腔醫學國家重點實驗室，陜西省口腔醫學重點實驗室，第四軍醫大學口腔醫院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫院禮士路門診部，北京100820）

他莫昔芬對牙髓干細胞體外分化的影響

王 娟1，劉寶剛2，馬逢樂1，何欣遙1，王志華1，何文喜1

（1．軍事口腔醫學國家重點實驗室，陜西省口腔醫學重點實驗室，第四軍醫大學口腔醫院牙體牙髓病科，陜西西安710032；2．第二炮兵總醫院禮士路門診部，北京100820）

目的：體外觀察他莫昔芬（Tamoxifen）對牙髓干細胞分化的作用。方法：培養人牙髓干細胞（hDPSCs），將hDPSCs用不同濃度的他莫昔芬刺激不同時間，CCK－8法檢測細胞的增殖情況；礦化誘導培養2周后茜素紅染色觀察礦化結節的形成，RT－PCR檢測各組礦化相關基因堿性磷酸酶（ALP）、骨鈣素（OCN）、骨唾液酸蛋白（BSP）、牙本質涎磷蛋白（DSPP）的表達水平。結果：10μmol／L他莫昔芬抑制hDPSCs增殖，其他濃度對hDPSCs無明顯影響；與對照組相比0．5、1、2．5、5、10μmol／L他莫昔芬均能促進礦化結節的形成，其中5μmol／L最明顯；且與對照組相比，5μmol／L他莫昔芬明顯上調礦化相關基因ALP、OCN、BSP和DSPP的mRNA表達水平。結論：他莫昔芬可明顯促進牙髓干細胞向成骨／成牙分化。

他莫昔芬；人牙髓干細胞；成牙分化；成骨分化

［Chinese Journal of Conservative Dentistry，2015，25（5）：294］

牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）是Gronthos等［1］（2000）利用酶消化法從牙髓組織中分離純化出的一種間充質干細胞，具有很強的增殖力、自我更新和多向分化能力，在一定誘導條件下可向特定的細胞類型分化，在牙髓修復和牙齒再生中發揮著重要的作用。研究發現牙髓干細胞在體外礦化液誘導下可形成成牙本質樣細胞，形成礦化結節［1］，但其分化的細胞內分子機制目前尚不清楚。

他莫昔芬（Tamoxifen）是一種雌激素受體抑制劑，在臨床有著廣泛的應用。研究發現他莫昔芬是治療雌激素受體陽性乳腺癌的“金標準”藥物［2］，臨床長期使用他莫昔芬會引起非酒精性脂肪性肝?。∟AFLD），同時也會導致骨質疏松［3－4］。體外研究證實，他莫昔芬能促進HepG2細胞的脂肪變性［5］。雌激素在調控干細胞分化方面有重要作用，黃素類物質可以促進骨髓間充質干細胞的成骨分化［6］，而他莫昔芬作為一種雌激素受體抑制劑，有關其對人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）的作用尚不清楚，他莫昔芬是否可以促進hDPSCs的分化，目前尚未見相關報道。

1 材料和方法

1．1 主要試劑和儀器

α－MEM培養基、I型膠原酶、Dispase酶、胰蛋白酶（Gibco公司，美國）；胎牛血清（HyClone，美國）；他莫昔芬（Invivo Gene，美國）、β－甘油磷酸鈉、地塞米松、維生素C、茜素紅（Sigma，美國）；細胞活力檢測試劑盒（上海恩晶生物）；細胞總RNA提取試劑盒（Omega，美國）；反轉錄試劑盒、Real－Time PCR試劑盒（Takara，日本）；二氧化碳恒溫孵箱（Thermo，美國）；超凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司）；倒置相差顯微鏡和照相系統（Olympus，日本）；Real－time PCR儀、ABI Prism 7500 Real－Time PCR系統（Applied Biosystems，美國）。

1．2 hDPSCs的體外分離和培養

臨床收集18～25歲志愿者正畸減數新鮮拔除的健康完整恒牙，750 mL／L乙醇擦拭牙體，含雙抗的PBS浸洗2次；無菌條件下取出牙髓，置PBS浸洗2次，將牙髓剪成1～2 mm大小的組織塊后，1 000 r／min離心5 min，棄上清；加入4 mg／L I型膠原酶37℃消化40 min；每10 min震蕩1次，共3次，1 000 r／min離心5min，棄上清；用含200 mL／L胎牛血清的α－MEM培養液清洗3遍；1 000 r／min離心5 min，收集細胞并用含200mL／L胎牛血清的α－MEM重懸后，接種于35 mm培養皿，置37℃，50 mL／L CO2恒溫培養箱中培養。3 d換液1次，倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況，細胞融合至80%時，50 g／L胰酶消化，用有限稀釋法挑取單細胞克隆擴大培養，備用。

1．3 他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響

將第3代hDPSCs用無血清10 mL／Lα－MEM培養液以3×103／孔接種于96孔板，共30孔，為防止邊緣效應，周邊36孔加200μL PBS。置于37℃，50 mL／L CO2孵箱24 h后，分為對照組（空白組）和分別含有0．5、1、2．5、5、10μmol／L他莫昔芬實驗組；分別在1、3、5、7 d時每孔加入10μL CCK－8工作液，置于37℃，50 mL／L CO2孵箱4 h后用酶聯免疫檢測儀測定450 nm處的吸光度值。每組設5個復孔，取平均值，實驗重復3次。

1．4 他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化的影響

1．4．1 實驗分組及礦化誘導培養

將P3代hDPSCs接種于6孔板中，實驗組分別加入含0．5、1、2．5、5μmol／L他莫昔芬的10 mL／L礦化誘導液（含10 mmol／Lβ－甘油磷酸鈉，50μg／mL維生素C，1×10－8mol／L地塞米松、100 mL／L FBS的α－MEM培養液）繼續培養2周；空白組為10 mL／Lα－MEM培養液，對照組加入10 mL／L礦化液均繼續培養2周。

1．4．2 RT－PCR檢測礦化相關基因OCN、ALP、BSP、DSPPmRNA

礦化誘導2周后各組細胞棄上清，PBS沖洗兩遍；將6孔板置于冰上，用RNA提取試劑盒提取細胞總RNA，并用反轉錄試劑盒合成cDNA（所有操作步驟均嚴格按產品說明）；利用NCBI網站的BLAST工具設計相關引物，并以cDNA為模板、GAPDH作為內參，按照TAKARA實時PCR試劑盒步驟用ABIPrism 7500 Real－Time PCR系統檢測各礦化相關基因堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、骨鈣素（osteonectin，OCN）、骨唾液酸蛋白（bone sialoprotein，BSP）、牙本質涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）mRNA的表達水平。所用引物由上海生工生物股份有限公司合成，各引物序列見表1。

表1 實時定量PCR所用引物名稱及序列

1．4．3 茜素紅染色觀察礦化結節的形成

不同刺激組細胞經礦化誘導2周后，PBS漂洗3遍，40 g／L多聚甲醛室溫固定30 min，PBS漂洗3遍后加入100 g／L（pH＝4．2）的茜素紅液，室溫閉光固定15 min后蒸餾水漂洗至染液無色，倒置顯微鏡觀察礦化結節形成情況，最后用PBS配置的100 g／L氯化十六烷基吡啶進行茜素紅定量分析，6孔板每孔加1 mL 100 g／L氯化十六烷基吡啶，置于搖床上混勻20 min后，將各組樣本取100μL，5個復孔加入96孔板，測定490 nm處的吸光度值，取各組平均值作統計分析。

1．5 統計學分析

采用SPSS 13．0軟件進行統計分析，組間比較用t檢驗，檢驗水準α＝0．05。

2 結果

2．1 不同濃度他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響

10μmol／L他莫昔芬組與對照組相比在第5天后表現出明顯的抑制hDPSCs增殖的作用，而0．5、1、2．5、5μmol／L刺激組對hDPSCs增殖無明顯影響（圖1）。

圖1 不同濃度他莫昔芬刺激hDPSCs后對其增殖能力的影響

2．2 他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化的影響

2．2．1 礦化誘導2周后茜素紅染色觀察各組礦化結節的形成

礦化2周后茜素紅染色結果表明（圖2），與對照組相比各組均能促進礦化結節的產生，其中5μmol／L刺激組礦化效果比其他刺激組更加明顯，鏡下及茜素紅定量結果（圖3～4）與肉眼觀察一致。

2．2．2 RT－PCR檢測他莫昔芬刺激礦化誘導2周后礦化相關基因變化

礦化2周后，與對照組相比，實驗組中礦化相關基因OCN、ALP、BSP、DSPP的mRNA表達水平，以5μmol／L組最顯著（圖5）。

圖2 礦化誘導2周后茜素紅染色情況

圖3 顯微鏡下礦化誘導2周后觀察（×40）

圖4 礦化誘導2周后茜素紅定量結果

圖5 礦化誘導2周后各組ALP、OCN、DSPP、BSPmRNA表達水平的比較

3 討論

干細胞是人體內較原始，未分化的細胞，具有自我更新、高度增殖和多向分化能力，可分為胚胎干細胞和成體干細胞。Gronthos等［1］第一次成功分離鑒定hDPSCs并闡明其生物學特性后，使得牙髓干細胞成為當下研究的新焦點。在中樞神經系統、骨組織和免疫系統中都存在雌激素受體［7］，雌激素在調節炎癥以及腫瘤細胞方面有重要的作用［8－9］。研究發現在牙周膜細胞中存在雌激素受體，女性更易于發生牙周炎可能與牙周膜細胞存在雌激素受體有關［10－11］。通過檢測人牙髓細胞雌激素基因表達水平以及成骨誘導分化，表明牙髓細胞表面存在雌激素受體，且雌激素能夠促進牙髓細胞的骨向分化［12－14］；在牙髓干細胞方面，也有研究證實雌二醇能夠通過NF－κB通路促進牙髓干細胞成骨／成牙分化的能力［15］，表明牙髓干細胞表面存在雌激素受體。

他莫昔芬作為臨床治療乳腺癌常用藥物，能夠作為雌激素受體抑制劑發揮作用，但常有骨質疏松及肝脂肪變性現象發生［4－5］。本實驗通過CCK－8實驗觀察他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響，結果顯示，與對照組相比，0．5、1、2．5、5μmol／L他莫昔芬對細胞存活率無明顯影響，而當濃度提高到10μmol／L時，hDPSCs增殖明顯抑制。為了排除他莫昔芬的藥物毒性導致細胞死亡所造成對細胞增殖的抑制，后續實驗選擇5μmol／L為藥物干預濃度。研究顯示，他莫昔芬抑制人垂體腺瘤細胞的增殖，并呈劑量依賴性［16］，20μmol／L可抑制大鼠星形膠質細胞的增殖，低于20μmol／L則無抑制作用［17］。他莫昔芬對hDPSCs增殖的影響不同于上述兩者可能是因為細胞來源及刺激濃度不同導致。

礦化能力是干細胞成骨的重要特性之一，組織內的鈣質大部分以磷酸鈣或碳酸鈣的形式存在。茜素紅AR－S法通過鈣離子與茜素紅特異性結合，可使礦化結節呈現鮮紅色，因此茜素紅染色是鑒定成骨分化或成牙分化的常用方法之一。本研究發現不同濃度他莫昔芬礦化誘導2周后，hDPSCs茜素紅染色結果顯示，與不加他莫昔芬礦化組相比，0．5、1、2．5、5μmol／L各組均能促進礦化結節形成，其中以5μmol／L組最顯著。表明他莫昔芬可促進hDPSCs成骨／成牙向分化。

成骨細胞和成牙本質細胞可分泌眾多礦化基質蛋白如ALP、OCN、BSP和DSPP等，這些基質蛋白在成骨細胞和成牙本質細胞分化過程中均發揮重要的作用。本結果發現，與不加刺激對照組比較，加入他莫昔芬刺激后礦化相關基因ALP、OCN、BSP、DSPPmRNA表達上調，但只有5μmol／L他莫昔芬組作用最顯著。表明他莫昔芬能夠促進牙髓干細胞的成骨／成牙分化，但具有濃度特異性。本結果與雌激素促進牙髓細胞和牙髓干細胞的骨向分化作用相矛盾，分析原因可能有：①與細胞來源不同有關；②他莫昔芬除抑制雌激素受體外，還可作為細胞自噬的誘導劑，在礦化過程中，他莫昔芬誘導牙髓干細胞自噬是否發揮作用，發揮多大作用，尚需進一步研究證實。

總之，本結果表明低濃度他莫昔芬對牙髓干細胞增殖無明顯影響，一定濃度的他莫昔芬對hDPSCs成骨／成牙分化具有促進作用。進一步深入研究他莫昔芬對hDPSCs作用的細胞內分子機制，將有利于探討臨床應用此藥物時對牙髓的影響，另外可探索其在牙髓損傷修復或再生中的應用。

［1］Gronthos S，Mankani M，Brahim J，et al．Postnatal human dental pulp stem cells（DPSCs）in vitro and in vivo［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2000，97（25）：13625－13630．

［2］Tomao F，Spinelli GP，Vici P，et al．Current role and safety profile of aromatase inhibitors in early breast cancer［J］．Expert Rev Anticancer Ther，2011，11（8）：1253－1263．

［3］Lee MH，Kim JW，Kim JH，et al．Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen［J］．Toxicol Lett，2010，199（3）：416－424．

［4］HattoriM，Horio A，SawakiM，etal．Assessmentof the clinical efficacy and safety of fulvestrant in heavily pretreated patients with hormone－receptor positivemetastatic breast cancer－a single－institution experience［J］．Gan To Kagaku Ryoho，2013，40（13）：2535－2538．

［5］ 趙斐，謝萍，姜佳麗，等．他莫昔芬體外促進HepG2細胞脂肪變性觀察［J］．實用肝臟病雜志，2014，17（1）：30－33．

［6］Strong AL，Ohlstein JF，Jiang Q，et al．Novel daidzein analogs enhance osteogenic activity of bone marrow－derived mesenchymal stem cells and adipose－derived stromal／stem cells through estrogen receptor dependent and independentmechanisms［J］．Stem Cell Res Ther，2014，5（4）：105．

［7］Enmark E，Gustafsson J?．Oestrogen receptors－an overview［J］．J Intern Med，1999，246（2）：133－138．

［8］Ushiyama T，Inoue K，Nishioka J．Expression of estrogen receptor related protein（p29）and estradiol binding in human arthritic synovium［J］．JRheumatol，1995，22（3）：421－426．

［9］Jeannon JP，Soames JV，Bell H，et al．Immunohistochemical detection of oestrogen and progesterone receptors in salivary tumours［J］．Clin Otolaryngol Allied Sci，1999，24（1）：52－54．

［10］Parkar MH，Newman HN，Olsen I．Polymerase chain reaction analysis of oestrogen and androgen receptor expression in human gingival and periodontal tissue［J］．Arch Oral Biol，1996，41（10）：979－983．

［11］Cao M，Shu L，Li J，etal．The expression of estrogen receptors and the effects of estrogen on human periodontal ligament cells［J］．Methods Find Exp Clin Pharmacol，2007，29（5）：329－335．

［12］Inaba T，Kobayashi T，Tsutsui TW，et al．Expression status of mRNA for sex hormone receptors in human dental pulp cells and response to sex hormones in the cells［J］．Arch Oral Biol，2013，58（8）：943－950．

［13］Juki?S，Prpi?Mehi?i?G，Talan－Hranilov＇c J，et al．Estrogen receptors in human pulp tissue［J］．Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2003，95（3）：340－344．

［14］Manokawinchoke J，Ritprajak P，Osathanon T，et al．Estradiol induces osteoprotegerin expression by human dental pulp cells［J］．Odontology，2014 Sep 26［Epub ahead of print］．

［15］Wang Y，Zheng Y，Wang Z，et al．10－7 m 17β－oestradiol enhances odonto／osteogenic potency of human dental pulp stem cells by activation of the NF－κB pathway［J］．Cell Prolif，2013，46（6）：677－684．

［16］鄒自英，袁成良，黃海，等．他莫昔芬影響人垂體腺瘤細胞增殖及其機制［J］．中國藥理學通報，2005，21（5）：614－617．

［17］何丹，謝敏杰，王偉，等．他莫昔芬對星形膠質細胞增殖的作用［J］．腦與神經疾病雜志，2012，20（1）：1－4．

The effect of tamoxifen on the osteoblastic／odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells in vitro

WANG Juan*，LIU Bao－gang，MA Feng－le，HE Xin－yao，WANG Zhi－hua，HEWen－xi
（*State Key Laboratory of Military Stomatology，Department of Operative Dentistry and Endodontics，School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Shaanxi Key Laboratory of Stomatology，Xi′an 710032，China）

AIM：To investigate the effects of tamoxifen on the osteoblastic／odontoblastic differentiation of human dental pulp stem cells（hDPSCs）in vitro．METHODS：hDPSCs were treated by different concentrations of tamoxifen．Kit－8 assay was applied to assess cell proliferation．Aftermineralization induction culture for 2 weeks，alizarin red S staining was used to observe themineral nodules，themRNA expression of the alkaline phosphatase（ALP），osteonectin（OCN），bone sialoprotein（BSP）and dentin sialophosphoprotein（DSPP）was detected by RT－PCR．RESULITS：Tamoxifen at 10μmol／L inhibited hDPSCs proliferation and lower concentration showed no effect．All concentration of tamoxifen increasedmineral nodule formation of hDPSCs，5μmol／L tamoxifen showed themost significant effect（P＜0．05）．Furthermore，themRNA expression of ALP，OCN，BSP and DSPPwasmarkedly upregulated by 5μmol／L tamoxifen treatment．CONCLUSION：Tamoxifen promotes mineralization and mineralization－related genes expression and might play a vital role on the differentiation of hDPSCs．

tamoxifen；human dental pulp stem cells；osteoblastic differentiation；odontoblastic differentiation

R780．2

A

1005－2593（2015）05－0294－05

10．15956／j．cnki．chin．j．conserv．dent．2015．05．007

2014－12－19；

：2015－03－31

國家自然科學基金資助項目（81271125，81470733）

王娟（1987－），女，漢族，山西長治人。碩士生（導師：何文喜）

何文喜，E－mail：hewenxi＠fmmu．edu．cn