體內和體外條件下不同濃度硅酸鈉和對應pH抑制粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)效果比較

牛黎莉,畢 陽,張盛貴,趙冠華,白小東,羅榮濤,段偉鵬

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

體內和體外條件下不同濃度硅酸鈉和對應pH抑制粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)效果比較

牛黎莉,畢 陽*,張盛貴,趙冠華,白小東,羅榮濤,段偉鵬

(甘肅農業大學食品科學與工程學院,甘肅蘭州 730070)

本文研究了不同濃度硅酸鈉和對應pH對T.roseum孢子萌發和菌落生長的抑制;100mmol/L硅酸鈉和對應pH12.60處理孢子3,6，9h后,損傷接種蘋果對其病斑直徑的影響;以及采用掃描電鏡觀察處理后孢子表面形態的變化。結果表明,不同濃度硅酸鈉和對應pH處理均能有效抑制T.roseum孢子的萌發和菌落生長,但硅酸鈉處理的效果要更好(p<0.05),硅酸鈉處理后的孢子其病斑直徑明顯低于對照(p<0.05),但經對應pH12.60處理后的孢子其病斑直徑則與對照相比無顯著性差異(p>0.05)。硅酸鈉處理的孢子表面粗糙,皺縮明顯,表面結構破壞,有明顯的內容物滲出;對應pH處理雖然也能導致孢子皺縮,但并未破壞其結構。上述結果表明,硅酸鈉比對應pH處理對T.roseum生長的抑制作用更為明顯。

T.roseum,硅酸鈉,pH,抑制

粉紅單端孢(Trichotheciumroseum)是重要的果蔬采后病原物,主要引起蘋果心腐病[1]和甜瓜的粉霉病[2-3]。此外,該病原還會引起梨[4-5]、葡萄[6]、番茄[7]、芒果[8]和堅果[9]等多種果蔬的腐爛。除了造成腐爛外,該病原物還具備較強的產生單端孢霉烯族毒素的能力,存在對人畜健康的潛在危害[10-11]。目前,控制由T. roseum引起的病害主要依賴于人工合成的殺真菌劑[8,12]。但長期使用不僅存在藥物殘留危害、污染環境、而且會增加病原物的抗藥性[13]。因此,亟需尋找新的、更為安全有效的控制方法。

硅是地球表面最為豐富的元素之一,可溶性硅酸鹽對植物的生長和發育具有多種重要的影響[14],其中已被FDA認定為一般公認安全的(GRAS)化學物質的硅酸鈉已廣泛用于控制多種作物的田間和采后病害[15-17],其該藥物對采后病害的控制作用機理涉及直接抑制病原物以及誘導寄主的防衛反應兩個方面,其對病原物的抑制作用具有廣譜性[18-20]。由于溶液呈堿性,因此推測硅酸鈉的抑菌機理可能與其所呈的堿性直接相關[18,21]。有報道表明,環境pH對真菌的生長具有重要的影響[22],環境pH能直接改變孢子體內的pH從而影響細胞代謝和能量合成[23]。但硅酸鈉對真菌的抑制機理是緣于pH還是硅酸根尚缺乏明確的報道。

本文擬研究不同濃度硅酸鈉和對應pH處理在體外條件下對T.roseum孢子萌發和菌絲生長的影響;通過采用不同濃度硅酸鈉和對應pH處理的孢子損傷接種,比較體內條件下蘋果果實病斑直徑的差異;采用掃描電鏡觀察硅酸鈉和對應pH處理后孢子的形態變化。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

T.roseum由甘肅農業大學食品科學與工程學院采后生物實驗室保存;蘋果(品種:紅星)于2013年10月采自甘肅省景泰縣條山農場,單果包裝后裝箱,80個/箱;硅酸鈉、氫氧化鈉為分析純 天津光復精細化工有限公司。

CX21光學顯微鏡 中國奧林巴斯;劍橋立體5-150掃描電鏡 英國劍橋LEO電子顯微鏡有限公司;PHS-3C酸度計 上海雷磁儀器廠。

1.2 孢子的收集

T.roseum劃線接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)上,28℃避光培養,培養10d后,加入含0.05% Tween-80的無菌水,用玻璃棒刮下平板上的病原菌孢子,然后轉入50mL三角瓶中,在WYX-A微型旋渦混合器上振蕩15s,再用雙層紗布過濾,濾液用血球計數板計數算出孢子懸浮液的濃度后,最后稀釋至所需濃度。

1.3 硅酸鈉溶液pH的測定

用無菌蒸餾水和液態的馬鈴薯葡萄糖培養基分別配制20、40、60、80、100mmol/L的硅酸鈉溶液,然后在28℃恒溫水浴鍋中恒溫30min后,用pH計測定溶液的pH,每個處理測定3次,求平均值。以下實驗中的對應pH溶液是用高壓滅菌的10mol/L的氫氧化鈉溶液調節無菌蒸餾水或培養基的pH與相應濃度的硅酸鈉溶液的pH相同。

1.4 硅酸鈉和對應pH對孢子萌發的影響

參照Li等[24]方法并稍加修改,用1%的水瓊脂倒板,等凝固后,用5mm的打孔器打孔,然后用無菌的鑷子將水瓊脂餅夾到滅菌的載玻片上(放置在滅菌的加了濾紙的培養皿中,并在各培養皿中加入2mL的無菌水),每個載玻片上放置3個,在每個瓊脂餅上分別滴加10μL的不同濃度(20、40、60、80、100mmol/L)的硅酸鈉溶液和對應pH溶液(11.96、12.30、12.41、12.50、12.60),并以無菌蒸餾水為對照,等藥液進入瓊脂,20min后,每個瓊脂餅分別加入10μL的孢子懸浮液(1×106個孢子/mL),放入28℃的培養箱中進行培養。15h后用光學顯微鏡進行孢子萌發的觀察,每個瓊脂餅觀察200個孢子,芽管長度達到孢子直徑的一半時,認為是萌發。

1.5 硅酸鈉和對應pH對菌絲生長的影響

參照Liu等[18]方法并做修改,將滅菌后PDA培養基冷卻至溫度60℃,分別加入不同質量的硅酸鈉使得硅酸鈉的終濃度為20、40、60、80、100mmol/L,充分溶解后,倒板。用滅菌的10mol/L的氫氧化鈉溶液調節PDA的pH與不同濃度硅酸鈉溶液的pH相同,約20mL均勻平鋪于直徑9cm的培養皿,以自然的PDA平板為對照,然后將培養10d的T.roseum平板,在邊緣用5mm的打孔器打取菌餅接于培養基中央,28℃黑暗培養5d后,用十字交叉法測定菌落直徑,每個濃度重復實驗3次。

1.6 硅酸鈉和對應pH處理后對蘋果損傷接種后病斑直徑的影響

參照Bi等[20]方法。選擇外觀整齊、大小均一、無損傷、無病蟲害的蘋果,用2%的次氯酸鈉溶液浸泡2min后用自來水沖洗后室溫晾干,再用75%的酒精對果實表面消毒,再用直徑3mm的無菌打孔器在果實上均勻刺5mm×3mm的傷口4個,立即接入10μL經100mmol/L硅酸鈉溶液和對應pH溶液分別處理3、6、9h的孢子懸浮液,濃度為1×106個孢子/mL,用保鮮袋包裝,在室溫條件下貯藏20d后,用十字交叉法測定病斑直徑。每個處理10個蘋果,3次重復,以接入同體積的無菌水作為對照。

1.7 硅酸鈉和對應pH處理后對孢子表面形態的影響

以100mmol/L硅酸鈉、對應pH以及無菌水處理,處理3、6、9h的孢子(5×106個)為樣本。孢子表面形態變化參照Li等[19]方法,在4℃下用2%戊二醛固定2h,PBS溶液洗3次,每次10min;再浸泡于體積分數為1%鋨酸溶液中,4℃下2h左右。用50%、70%、95%和100%的系列乙醇各脫水10min。醋酸異戊酯置換20min。臨界點干燥,真空鍍金。制好的掃描電鏡標本在掃描電鏡下觀察,并采集照片。

1.8 數據處理

全部實驗數據用Microsoft Excel 2007和SPSS 16.0數據處理系統進行統計處理,計算標準偏差(±SE)并進行Duncan s多重差異顯著分析,圖中的不同字母表示0.05水平上的差異顯著性。

2 結果與討論

2.1 不同濃度硅酸鈉溶液的pH

20、40、60、80和100mmol/L的硅酸鈉添加于培養基溶液后,pH在10.44～12.30之間變化,而相應濃度硅酸鈉的水溶液的pH在11.96～12.60之間變化(表1);在相同的硅酸鈉濃度下,培養基中加入硅酸鈉的pH稍低于添加于無菌蒸餾水中的pH。

表1 不同濃度硅酸鈉在液態培養基和無菌蒸餾水中的pH(±SE)Table 1 pHs of sodium silicate at different concentration in PDB solution and sterile distilled water(±SE)

2.2 硅酸鈉和對應pH處理對孢子萌發的影響

不同濃度硅酸鈉和對應pH處理均能有效抑制孢子萌發,但是硅酸鈉和對應pH處理之間存在差異。硅酸鈉濃度越高,其抑制效果便越好;而對應pH處理雖然也能顯著抑制孢子萌發,但其抑制效果遠不及硅酸鈉(圖1)。當硅酸鈉濃度在20mmol/L時,沒有抑制孢子萌發,而對應pH溶液則顯著抑制了孢子萌發;當硅酸鈉濃度達到40mmol/L時,其抑制效果開始顯現,且作用明顯,其孢子萌發率分別比對照和對應pH低48%和8%;隨著硅酸鈉濃度的進一步增加,其對孢子萌發率的抑制效果便顯著增強。相比而言,當對應pH從12.30增至12.50時,其抑制效果保持穩定,并未進一步增強;當硅酸鈉濃度在100mmol/L時幾乎完全抑制孢子萌發,處理孢子的萌發率僅為對照和對應pH12.60的2%和4%。

圖1 不同濃度硅酸鈉和對應pH處理對T.roseum孢子萌發的影響Fig.1 Effect of sodium silicate at different concentration and corresponding pH on conidia germination of T. roseum注：1～6分別表示硅酸鈉濃度0、20、40、60、80、100mmol/L；對應pH溶液的pH分別為8.08、11.96、12.30、12.41、12.50、12.60；標有不同字母表示有顯著性差性p<0.05。

2.3 硅酸鈉和對應pH處理對菌落直徑的影響

不同濃度硅酸鈉和對應pH處理均能顯著抑制T.roseum的菌落生長,但抑制效果存在差異,硅酸鈉處理的抑制效果要顯著優于對應pH處理(圖2)。當硅酸鈉在20mmol/L時,就對菌落生長表現抑制,但不及對應pH10.44處理;隨著硅酸鈉處理濃度的增加,對菌落生長的抑制效果也顯著增強,且各硅酸鈉濃度處理的效果均顯著優于對應pH處理。當硅酸鈉濃度為40mmol/L時,其菌落生長僅分別為對照和對應pH的31.4%和42.5%;當硅酸鈉濃度為100mmol/L時,則完全抑制了菌落直徑的擴展。

圖2 不同濃度硅酸鈉和對應pH處理對T.roseum菌落生長的影響.Fig.2 Effect of sodium silicate at different concentration and corresponding pH on colony diameters of T. roseum注：1～6分別表示硅酸鈉濃度0、20、40、60、80、100mmol/L;對應pH溶液的pH分別為7.01、10.44、10.96、11.34、11.86、12.30；標有不同字母表示有顯著性差異,p<0.05。

硅酸鈉所顯示的真菌抑制活性,與其溶液本身的堿性有關[18,21]。由于硅酸鈉屬于強堿弱酸鹽,當溶液pH大于11時,能夠解離出Na+和硅酸根離子[25]。孢子萌發和菌落直徑結果顯示,當硅酸鈉的濃度為40mmol/L時,此時溶液的pH接近11,硅酸鈉的抑制作用明顯增強。而且濃度越高,其抑菌效果越好。對照PDA培養基的自然pH為7.01,而20mmol/L硅酸鈉對應的pH為10.44,其pH變化較大,這種環境pH的突然改變,使得菌絲生長和孢子萌發均受到顯著的抑制。隨著硅酸鈉濃度的提高,其對應pH的增幅不大,對其菌絲生長和孢子萌發的抑制效果也變化不大。硅酸鈉濃度為100mmol/L時,溶液中Na+的濃度僅為200mmol/L,略高于生理鹽水中的154mmol/L Na+濃度。因此,Na+通過滲透影響所引起的抑菌作用不大。硅酸鈉對孢子萌發和菌絲生長的抑制則主要緣于硅酸根離子。

2.4 硅酸鈉和對應pH處理的孢子對損傷接種蘋果病斑直徑的影響

孢子經100mmol/L硅酸鈉處理后再損傷接種蘋果,其病斑直徑明顯低于對照;但孢子經對應pH12.60處理后再損傷接種蘋果,則與對照之間無顯著差異。隨著硅酸鈉處理時間的延長,處理孢子損傷接種后的病斑直徑會進一步縮小,當處理9h時,幾乎完全抑制了病斑的擴展(圖3)。由于蘋果果肉中4左右的低pH可中和對應pH處理的堿性孢子,使孢子微環境趨于正常pH。同時,果肉本身的高含水量可使得表面皺縮、滲透勢發生改變的孢子重新吸收水分而恢復正?；钚?。而硅酸鈉處理由于破壞了孢子的結構,即使外界環境提供大量水分并中和堿性pH,孢子正?；钚砸搽y以恢復,從而導致其致病力明顯減弱或消失。在硼酸鹽[26],氯化鋁和焦亞硫酸鈉[13]等無機鹽處理導致Botrytis cinerea和Fusarium sambucinum孢子形態破壞、以及菌體致死的現象時也觀察到類似的結果。

圖3 100mmol/L硅酸鈉和對應pH溶液處理不同時間的孢子對損傷接種蘋果病斑直徑的影響 Fig.3 Effect of wound-inoculated with spores of T.roseum treated with sodium silicate at 100mmol/L and corresponding pH at 12.60 for different time on lesion diameter of apple fruits注：標注不同字母表示有顯著差異性，p<0.05。

2.5 硅酸鈉和對應pH處理對孢子表面形態的影響

100mmol/L硅酸鈉及對應pH12.60處理顯著改變了孢子的表面形態,處理時間越長,形態的改變也就越明顯,但硅酸鈉處理對孢子的破壞作用更大(圖3)。用無菌蒸餾水處理的對照孢子在3、6和9h三個處理時間段其形態變化不大,孢子表面形態完整,形狀飽滿(圖4A～圖4C);經100mmol/L硅酸鈉處理后,孢子皺縮,表面粗糙,凹陷明顯(圖4D～圖4F),處理9h時甚至可以觀察表面結構破壞,有明顯的內容物滲出(圖4F);同樣,對應pH12.60處理3h的孢子其形態變化與對照相比差異不大(圖4G),隨著處理時間的延長,孢子皺縮顯著增強,當處理9h時,表面粗糙,凹陷現象突出,但結構依然完整(圖4H,I)。

圖4 100mmol/L的硅酸鈉和對應pH處理對T.roseum孢子表面形態的影響 Fig.4 Effect of sodium silicate at 100mmol/L and corresponding pH at 12.60 treatments on spore morphology of T.roseum注:圖A,B和C為對照分別處理3,6，9h;圖D,E和F為100mmol/L硅酸鈉分別處理3,6，9h;G,H和I為pH12.60分別處理3,6，9h,圖中EX表示滲出物。

3 結論

本研究首次發現,不同濃度硅酸鈉和對應pH處理均能有效抑制T.roseum孢子的萌發和菌落生長,但硅酸鈉處理的效果更好。用經100mmol/L硅酸鈉處理后的孢子損傷接種蘋果,其病斑直徑明顯低于對照,但經對應pH12.60處理后的孢子損傷接種,其病斑直徑則與對照相比無顯著性差異。掃描電鏡觀察發現,硅酸鈉處理的孢子表面粗糙,皺縮明顯,表面結構破壞,有明顯的內容物滲出;對應pH處理雖然也能導致孢子皺縮,但并未破壞其結構。由此表明,硅酸鈉比對應pH處理對T.roseum生長的抑制作用更為明顯。

綜上所述,硅酸鈉對T.roseum孢子的萌發和菌落生長的良好抑制效果除了與其改變環境pH外,更多地涉及硅酸根離子的影響;T.roseum孢子致病力的顯著降低則完全決定于硅酸根離子對孢子結構的破壞。至于硅酸根離子如何破壞孢子的結構并在抑菌中發揮作用尚有待進一步研究。

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Comparison of inhibitory effect of sodium silicate atdifferent concentrations and corresponding pHonTrichotheciumroseuminvitroandinvivo

NIU Li-li,BI Yang*,ZHANG Sheng-gui,ZHAO Guan-hua,BAI Xiao-dong,LUO Rong-tao,DUAN Wei-peng

(College of Food Science and Engineering,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China)

The inhibitory effect were assayed on spore germination and colony growth ofT.roseumtreated with sodium silicate at different concentration and corresponding pH. The lesion diameter was determined in apple fruits inoculated with pores treated with 100mmol/L sodium silicate and corresponding pH12.60 for 3,6 and 9h. Morphology of spores treated with 100mmol/L sodium silicate and corresponding pH12.60 was observed by SEM. The results showed that sodium silicate at different concentration and corresponding pH significantly inhibited the spore germination and colony growth. However,sodium silicate treatments showed more effective than corresponding pH treatments(p<0.05). Apples inoculated with spores treated with sodium silicate had a smaller lesion diameter when compared with the control;however,no difference was found in lesion diameter treated with corresponding pH and the control. Spores treated with sodium silicate appeared rough,significant shrinkage,damaged structure and contents exudate. The treatment with corresponding pH also caused the shrinkage of spores,but the structure was not damaged. It was suggested that sodium silicate treatment caused more severe damage than corresponding pH treatment againstT.roseum.

T.roseum;sodium silicate;pH;inhibition

2014-10-27

牛黎莉(1979-)，女，在職博士，講師，研究方向：采后防腐和保鮮。

*通訊作者:畢陽(1962-)，男，博士，教授，研究方向：采后防腐和保鮮。

國家自然基金面上項目(31371869);國家自然基金面上項目(31071835)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)13-0157-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.024