超聲波處理對蕎麥種子營養物質累積以及抗氧化活性的影響

張冬晨,劉海杰,劉 瑞,郝建雄

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018)

超聲波處理對蕎麥種子營養物質累積以及抗氧化活性的影響

張冬晨1,劉海杰1,劉 瑞1,郝建雄2,*

(1.中國農業大學食品科學與營養工程學院,北京 100083;2.河北科技大學生物科學與工程學院,河北石家莊 050018)

采用超聲波對蕎麥種子進行預處理,測定其萌發率,比較了萌發過程中水分含量、可溶性糖、粗蛋白、總酚和總黃酮的含量,以及體外抗氧化活性的變化。結果表明:10～20min的超聲波處理可以提高蕎麥的發芽率,而且萌發后蕎麥芽的品質有所提高,其抗氧化物質有一定程度的累積,體外抗氧化活性增強。其中以超聲波處理20min效果最理想,發芽率提高至94%,總酚含量達到180.8μg GAE/mL,總黃酮含量為156.701mg蘆丁/g 樣品,DPPH自由基清除活力達到最大值(0.197mg Trolox eq/g凍干樣)。蕎麥萌發之前采用適宜的短時間的超聲波處理,不僅能促進萌發,還能促進其抗氧化能力的提高。

超聲波,蕎麥,營養物質累積,抗氧化

蕎麥屬于蓼科(Polygonaceae)蕎麥屬,主要有甜蕎(FagopyrumesculentumMoench)和苦蕎(FagopyrumtaraicumGaerth)兩個品種。蕎麥含有豐富的蛋白、碳水化合物、不飽和脂肪酸及維生素,尤其是葉綠素和黃酮類化合物,如蘆丁和槲皮素等。蕎麥中的黃酮類化合物具有多種生理功能,如抗氧化性、清除自由基、抗衰老等。蕎麥籽粒萌發,不僅能降低胰蛋白酶抑制劑的活性,還能抑制蘆丁降解,發揮蕎麥的保健功效。而且作為一種營養豐富的新型蔬菜,鮮嫩可口。但是蕎麥發芽過程中發芽率較低,易感染微生物等問題阻礙了其在生產生活中推廣。

超聲波發展于20世紀,在各領域應用中展現出獨特的作用,引起了國內外學者的普遍關注。當超聲波在介質中傳播時,超聲波與兩相或多相介質相互作用,使介質發生物理和化學的變化,從而產生一系列力學、熱學、電磁學和化學的超聲效應[1-2]。對食品進行超聲波處理將引起食品成分的物理和化學變化。超聲波處理可以降解大分子,使其發生機械性斷鍵以及自由基的氧化還原[3]。此外,還可以提高肉品品質,促進酵母繁殖,縮短發酵時間,增加酒香[4-5]。食品行業中,超聲波還普遍應用于提取,殺菌,食品添加劑的合成,干燥除氣,結晶冷凍,乳化均質等。近年來,超聲波作為一種無公害的物理處理手段在生物科學領域已得到了廣泛的應用,植物種子經超聲波處理后,破壞植物細胞和細胞膜結構,從而增加細胞內容物通過細胞膜的穿透能力,提高活力、促進萌發及幼苗的生長、增加抗逆能力及作物產量[6-7]。

本研究采用超聲波處理蕎麥種子,研究其對發芽率的影響,并考察了營養物質尤其是黃酮類的含量變化以及體外抗氧化情況的影響,以期找到一種既能促進種子萌發又能提高營養價值的蕎麥芽生產新技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甜蕎種子 太谷縣晉農瓜菜種子服務部;蘆丁標準品 美國Sigma-Aldrich公司,分析純,98%;抗壞血酸 美國Sigma-Aldrich公司,分析純,≥99%;其他試劑 均為分析純。

超聲波清洗儀KQ-600DE 昆山市超聲儀器有限公司;凱氏定氮儀KYD-9820 北京市通潤源機電技術有限公司;真空冷凍干燥機LGJ-18 北京四環科學儀器廠;臺式離心機TDL-40B 上海安亭科學儀器廠;紫外-可見分光光度計UV-1600 日本島津公司;微孔板混合器NS-P 日本ASONE;酶標儀model 550 美國Bio-Rad Laboratories;回旋振蕩器WSZ-100A 上海一恒科技有限公司;高速均質機T25basic 德國IKA Labortechnik。

1.2 實驗方法

1.2.1 蕎麥芽樣品準備 取顆粒飽滿、無生理缺陷、大小均一的蕎麥(20±1)g,用自來水洗滌1 遍,加入 60mL蒸餾水,放入恒溫發芽培養箱中。在 25℃,濕度為80%條件下浸泡 6h,然后放入超聲波清洗儀中進行處理(工作頻率:40kHz;超聲功率480W;溫度:24℃),處理時間設置為10、15、20、25、30min 5個組,3次重復。以不用超聲處理的實驗組(0min)為對照組。最后將經過預處理的實驗樣品放入 25℃恒溫培養箱中進行培養。每8h淋澆一次水。一次澆水量為100mL。至第9d結束。凍干,磨成粉,備用。

1.2.2 發芽率測定 自開始培養起,每隔12h,依次測量其發芽率(胚軸突破種皮 1mm 即為萌發),連續測定3d,每組重復 3次,直至個別處理組發芽率達到100%。

1.2.3 水分含量的測定 參照國標GB/T 5009.3-2010,測定各處理組蕎麥芽鮮樣的水分含量。

1.2.4 可溶性糖含量的測定 參照蒽酮比色法測定各處理蕎麥芽的凍干樣的可溶性糖含量。

1.2.5 粗蛋白含量的測定 參照國標GB/T 5511-2008,測定各處理組蕎麥芽的凍干樣的粗蛋白含量。

1.2.6 總酚類的測定 根據福林-酚比色法[8],準確稱取蕎麥芽樣品1.0000g(精確至0.0001g),分別加入100mL 80%乙醇,室溫下過夜振蕩提取(100r/min),過濾提取液,定容至100mL,0.45μm有機膜過濾后,待測定。

取50μL樣品,加入Folin-Ciocalteu稀釋試劑 1.0mL,7.5% Na2CO3溶液1.0mL,用蒸餾水定容5mL,在室溫下靜置30min,765nm比色測定,試劑空白為參比。以沒食子酸繪制標準曲線。結果以每毫升溶液中沒食子酸(GAE)當量表示樣品中總酚含量。

1.2.7 氯化鋁法測定總黃酮含量 參照Balbaa[9]的方法,取待測樣品的凍干樣0.2g置于50mL圓底燒瓶中,加入25mL甲醇加熱回流提取1h,趁熱過濾,置于50mL容量瓶中,濾紙濾渣再加20mL甲醇加熱回流30min,合并濾液,用甲醇定容至50mL。取2.5mL提取液,依次加入5mL 50%乙醇,3mL 25g/L AlCl3和5mL 100g/L乙酸鈉。用50%乙醇定容至25mL,40min后在417nm下測定吸光值,以蘆丁標準液繪制標準曲線。

1.2.8 還原力的測定 樣品前處理:1g樣品凍干粉,加入20mL蒸餾水,16000r/min均質2min,懸濁液煮沸15min以鈍化酶活,然后與60℃水浴搖床中150r/min下震蕩提取1h。之后于3800r/min轉速下離心15min,取上清液并用0.45μm微孔水系濾膜過濾,得到樣品水提物,4℃保存備用。

還原力的測定參考Oyaizu[10]的方法。以0.5mg/mL的VC作為比較標準。

1.2.9 DPPH自由基清除活性的測定 樣品前處理方法同1.2.8的前處理方法。DPPH自由基清除活性的測定根據改進的Fenglin檢測方法進行[11],結果表示為mg Trolox eq/g凍干粉。

1.2.10 數據分析與處理 實驗結果均采用三次重復的平均值,每次重復的平行至少三個。作圖采用Microsoft Excel 2013和Graphpad Prism 5,用SPSS進行Duncan方差分析,結果以平均值±方差的形式表示。顯著性水平為p<0.05。

2 結果與討論

2.1 超聲波處理對蕎麥芽的發芽率的影響

圖1 表示的是不同超聲波前處理時間對蕎麥發芽率的影響。由圖中可以看出,隨著發芽時間的延長,超聲波處理20min的處理組發芽率一直高于其他幾個處理組,在60h發芽率幾乎達100%,15min處理組的發芽率也較高,其他幾個處理組的發芽情況均比對照組差。這說明,超聲波處理20min的效果最好。

圖1 超聲波處理對發芽率的影響Fig.1 Effect of ultrasonic treatment on germination rates of buckwheat sprouts

少量的超聲波能刺激細胞分裂,中等量的超聲波會抑制細胞分裂,大量的能引起細胞死亡,長時間、大劑量的超聲波處理則會造成負面的不可逆的影響[12]。Maryam Yaldagard[13]用超聲波處理大麥種子,發現處理組(處理時間為5～15min)的發芽率高于未處理組,同時也縮短了大麥種子的發芽期,尤其以處理15min效果最明顯。也有人曾經用超聲波處理白菜和菠菜種子,發芽率達到96%,而未處理組能達到88%。本實驗中,蕎麥種子本身發芽率較低,未處理組發芽率僅為60%左右,20min超聲波處理組發芽率超過90%,遠遠高于未處理組。而30min超聲波處理組發芽率僅僅為50%,這可能主要是因為,超聲波處理時間為10～20min時,處理時間短,因而起到少量的刺激作用,使15、20min處理組的發芽率高于未處理組,25、30min處理組由于處理時間長而導致超聲波對種子起到破壞作用,因而發芽率低于未處理組。

2.2 超聲波處理對蕎麥芽水分、可溶性糖和粗蛋白含量的影響

發芽是將有活性的蕎麥種子從休眠的靜態躍升為生理活動頻繁的動態的過程,此時呼吸作用增強,酶的種類和數量顯著增加,酶活性的加強使其新陳代謝在較高水平上進行,同時啟動大量酶促反應進行生物轉化,儲存的各種物質被轉化和提升為可供新生命利用的高活性成分,使生物活性物質含量顯著增加。

由圖2a可以看出,與對照組相比,不同超聲波處理時間(10～25min)的處理組的水分含量顯著差異(p<0.05)。其中,10～25min處理組的水分含量顯著地高于對照組,并在20min處達到最高值(91.66%);30min處理組與對照相比并無顯著性差異,水分含量達最小值(87.62%)。

圖2b是不同超聲波處理時間對蕎麥芽可溶性糖含量的影響。處理組之間差異顯著(p<0.05)。其中在30min處達到最大值(6.54%),在20min處達最小值(3.63%)。與水分含量整體變化趨勢相反。碳水化合物是蕎麥中的主要營養成分,蕎麥種子中主要的碳水化合物是淀粉。隨著種子的萌發,其淀粉酶活性增強,淀粉被分解為可溶性的糖類(二糖、三糖、四糖等),其含量增加,后期可溶性糖被分解,成為小分子的游離糖(主要為葡萄糖、果糖),此時可溶性糖含量逐漸降低,游離糖含量相應升高,在種子的呼吸作用中被消耗。Kim Sum-lim等人[14]研究報道,隨著蕎麥發芽時間的延長,二糖、三糖和四糖的數量逐漸減少,單糖(主要為葡萄糖和果糖)含量快速增加,至發芽第8d時,葡萄糖和果糖的含量分別為2.46、1.67g/100g。

圖2c中超聲波處理后,蕎麥芽的粗蛋白沒有顯著性差異(p>0.05)。處理組之間總的含氮物質并沒有隨著超聲波處理時間的不同而發生變化。所以超聲波處理對與蕎麥芽的粗蛋白含量影響不大。

數據采集系統主要由上位機、485主站單元和31個485從站單元組成,原理框圖如圖1所示。上位機和主站單元通過以太網接口通信,主站單元建立485總線,其內部的FPGA解析上位機下發的命令后轉發到RS-485總線上,與某一從站單元匹配成功后進行通信,并將接收的數據經處理打包后上傳至上位機。根據命令可更改從站單元之間的查詢模式,實現了一主站多子站間的高速485通信。

圖2 超聲波處理對蕎麥芽基本營養成分的影響Fig.2 Effect of ultrasonic treatment on basic nutrition compositions of buckwheat sprouts注:相同字母表示差異性不顯著(p>0.05),不同字母表示差異性顯著(p<0.05),圖3～圖6同。

發芽使種子的營養價值得以提高。由以上三種基本營養成分的變化可以看出,20min處理組種子的營養情況最好,30min處理組種子的營養情況最差。但是總體上來看,處理時間為10～20min的處理組與空白相比,營養成分均有所改善,而大于20min的處理組(25、30min)營養成分與空白組相比不及空白組。趙萌萌等[15]研究了超聲波處理對黃豆種子品質的影響,研究發現,一定時間的超聲波處理對黃豆萌發率、發芽指數等均有促進作用,對萌發后黃豆芽的品質具有增益效應,其中以超聲波處理25min效果最理想。這可能是由于種子不同,其種皮厚度、成分等均有所不同,因而最適宜的處理條件也略有差異。

2.3 超聲波處理對于蕎麥芽的抗氧化的影響

2.3.1 超聲波處理對于蕎麥芽的總酚含量的影響 蕎麥種子中酚類物質含量豐富,發芽過程會使蕎麥種子中的總酚含量增加[16]。

圖3表示的是不同超聲波處理后蕎麥芽中總酚含量的變化情況。由圖3可以看出,與對照組相比,采用超聲波對蕎麥種子進行前處理后,其發芽后總酚含量有顯著性差異(p<0.05)。其中,處理時間為10～20min的處理組,總酚含量高于對照組,并且在20min處達到最大值(180.8μg GAE/mL)。處理時間>20min的處理組,總酚含量顯著低于對照組(p<0.05),并且在30min達到最小值(129.8μg GAE/mL)。

圖3 超聲波處理對蕎麥芽總酚含量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic treatment on phenolic composition content of buckwheat sprouts

2.3.2 超聲波處理對于蕎麥芽的總黃酮含量的影響 黃酮類化合物是蕎麥多酚最主要的成分,是蕎麥中最重要的生物活性物質,賦予蕎麥眾多的生理功能。國內外學者對蕎麥的殼、全籽粒、糊粉層、葉、莖、花中生活類黃酮資源的化學組成、抗氧化性和穩定性進行了大量研究[17-18]。

蘆丁是蕎麥黃酮類化合物的主要組成部分,也是蕎麥黃酮類物質最突出的。此外,槲皮素也是蕎麥中一種重要的黃酮類化合物。萌發處理可以克服蘆丁的降解,使其含量顯著增加,同時提高其利用率。它們的抗氧化性的檢測方法眾多,此方面的報道也比較多,此外,蕎麥黃酮的抗氧化、抗高血壓、抗炎活性也是人們研究的一部分[19-21]。

圖4表示不同超聲處理時間對于蕎麥芽的總黃酮含量的影響。本實驗中測得蕎麥芽的總黃酮含量與相關文獻中報道的蕎麥芽的總黃酮含量相一致[22]。由圖4可以看出,與對照組相比,各處理均有顯著性差異(p<0.05)。其中,當處理時間為10～20min時,總黃酮含量顯著增高,其中在20min處取得最高值(156.70mg蘆丁/g 樣品)。當處理時間為25～30min時,總黃酮含量顯著低于對照組,并且在30min處取得最小值(116.84 mg蘆丁/g 樣品)。

圖4 超聲波處理對蕎麥芽的總黃酮含量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic treatment on total flavonoids of buckwheat sprouts

前人研究表明[23-24],長時間日照、適宜的溫度、鈣離子水溶液均能促進蕎麥中黃酮類物質的合成。任順成[22,25]發現,蕎麥芽中的黃酮類物質在發芽第7d可達最大值,約為120mg 蘆丁/g 樣品。本研究固定蕎麥發芽的環境,改變超聲波處理時間,黃酮類化合物的含量升高,其中最大值為156.70mg蘆丁/g 樣品,顯著高于其他處理組。這可能是由于超聲波的空化作用引起的熱效應有利于蕎麥的發芽。此外,超聲波在低強度及適宜頻率條件下具有空穴作用、磁致伸縮作用和機械振蕩作用,改變酶分子構象,促進細胞代謝過程中底物與酶接觸,促進產物的釋放,從而增加酶的生物活性[6]。苯丙氨酸解氨酶是黃酮類合成過程中的關鍵性限速酶,種子中的苯丙氨酸解氨酶活性升高,因此黃酮的含量升高。而過長時間的超聲波處理,則會導致黃酮的分解,促進其氧化還原反應的發生,因此,長時間(25～30min)的超聲波處理降低了蕎麥芽的抗氧化能力。

圖5 超聲波處理對蕎麥芽的總還原力的影響Fig.5 Effect of ultrasonic treatment on reducing power of buckwheat sprouts

2.3.4 超聲波處理對DPPH自由基清除活性的影響 蕎麥芽的DPPH自由基清除活性如圖6所示,與對照組相比,10～20min處理組DPPH自由基清除活性有顯著差異(p<0.05)。其中,處理時間為20min時達到最大值(0.197mg Trolox eq/g凍干樣),30min時達最小值(0.119mg Trolox eq/g凍干樣)。

圖6 超聲波處理對于蕎麥芽的DPPH自由基清除活性的影響Fig.6 Effects of ultrasonic treatment on DPPH scavenging activity of buckwheat sprouts

與對照組相比,10～20min的超聲波處理整體上呈一個上升的趨勢,實驗測得的蕎麥芽的總酚含量、總黃酮含量、還原力以及DPPH自由基清除活性均提高,尤其以20min的處理組最高。這說明采用超聲波處理蕎麥種子在一定的時間內可以提高芽的抗氧化性,這主要是因為苯丙氨酸解氨酶的活性以及其底物苯基丙氨酸的含量升高,促進其代謝產物黃酮的生成時間[26]。過長的超聲波處理總酚含量,總黃酮含量還原力和DPPH自由基清除活性都明顯降低,這是由于過長時間的超聲波處理使種子的活性降低,酶失活,因而黃酮類的含量降低。Chen Yi-ping[27]等發現超聲波可以通過增強小麥種子的抗氧化酶系的活性從而清除ROS(活性氧族)。趙萌萌[15]等研究發現超聲波處理,尤其是超聲處理25min可以顯著增強黃豆中黃酮的含量。本研究中,超聲波處理的最適宜時間為20min,此時蕎麥的抗氧化能力顯著增強,這可能是因為,超聲波處理的空化作用引起的機械效應和熱效應等,使蕎麥種子溫度升高,種皮破裂,水分易滲透,苯丙氨酸解氨酶活性提高,從而可以使黃酮類物質得到富集,提高其抗氧化能力,但是不同種子最適宜的處理時間不同。

3 結論

本研究主要檢測了用超聲波對蕎麥種子進行前處理,不同時間對種子的發芽情況、發芽后營養成分的含量以及抗氧化情況的影響。對于蕎麥種子來說,20min以內(10～20min)的超聲波處理之后并沒有明顯改善其發芽情況,但是可以提高蕎麥芽的營養品質:顯著提高其水分含量,可直接供種子呼吸所需要的單糖(葡萄糖、果糖)含量,降低可溶性糖含量。此外,還可以富集具有抗氧化性的黃酮類化合物,提高其抗氧化能力,尤其以處理時間為20min達到最佳狀態。但是當處理時間超過20min時,從發芽情況,營養成分的含量以及抗氧化情況來說,種子均不處于良好狀態。因而長時間的超聲波處理對于蕎麥種子來說是不利的。因此,采用適宜短時間的超聲波處理蕎麥芽可以改善其發芽情況以及抗氧化情況,一方面其可作為日?？墒褂玫难坎松钊氪蟊娚?另一方面其抗氧化性可以促進其作為營養保健品投放市場。

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Effect of ultrasonic treatment on nutritional accumulation and antioxidant activity of common buckwheat

ZHANG Dong-chen1,LIU Hai-jie1,LIU Rui1,HAO Jian-xiong2,*

(1.Colleague of Food Science and Nutritional Engineering,China Agriculture University,Beijing 100083,China;2.Colleague of Life Science and Engineering,Hebei Technology University,Shijiazhuang 050018,China)

To determine the effect of ultrasonic treatment on buckwheat sprouts,the common buckwheat seeds were pretreated with ultrasonic in different time. The germination rate,as well as the content of water,soluble sugar,crude protein,phenolic composition and total flavonoids were determined. Meanwhile,their antioxidant activities(reducing power and DPPH radical scavenging activity)were determined and then compared. The results showed that a certain time(10～20min)treatment could promote germination rate,all the determined nutritional composition and the antioxidant activities. The treatment with 20min had the best antioxidant results with the total phenol content was up to 180.8μg GAE/mL,the total flavonoids content was 156.701 mg rutin/g sample and the DPPH radical scavenging activity had a maximum value. Meanwhile,the treatment also increased the germination rate,which was 94%. Therefore,a proper and short-time ultrasonic treatment do well to the germination and antioxidant activity.

ultrasonic;common buckwheat;nutritional accumulation;antioxidant activity

2014-06-11

張冬晨(1990-)，女，碩士研究生，主要從事食品加工新技能方面的研究。

*通訊作者:郝建雄(1979-)，男，博士，副教授，研究方向：食品加工新技術。

國家自然科學基金資助項目(31201437)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2012BAD29B04-1-1)。

TS201.2

A

1002-0306(2015)07-0069-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.07.005