一株鐵還原菌FeRB-FL1404的分離和鑒定及其去除高嶺土中Fe(Ⅲ)研究

林玉滿，陳小嵐， 魏招娣，許旭萍（.福建師范大學環境科學與工程學院，福建 福州 50007；.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 50007；.福建師范大學化學與化工學院，福建 福州 50007）

一株鐵還原菌FeRB-FL1404的分離和鑒定及其去除高嶺土中Fe(Ⅲ)研究

林玉滿1，陳小嵐2， 魏招娣3，許旭萍2
（1.福建師范大學環境科學與工程學院，福建 福州 350007；2.福建師范大學生命科學學院，福建 福州 350007；3.福建師范大學化學與化工學院，福建 福州 350007）

【摘 要】以高嶺土為選擇性培養基，從錳礦樣品中分離到一株能夠還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的鐵還原菌FeRBFL1404。經形態特征觀察、生理生化特征和16S rDNA序列分析，鑒定其為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)?？疾炝艘云咸烟?、蔗糖、草酸鈉、檸檬酸三鈉為碳源對FeRB-FL14043菌還原高嶺土中Fe2O3(Fe(3+))的影響，結果表明葡萄糖作為碳源，高嶺土除鐵效果最好；在葡萄糖濃度為1%、礦漿濃度為10%、鐵還原菌液加量為5%、溫度為28℃、pH值6.5條件下厭氧培養10d，高嶺土中Fe(3+)去除率為46.07%，Fe2O3含量由0.89%降低至0.48%，自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%。

【關鍵詞】鐵還原菌；分離；高嶺土；除鐵；碳源

1　引言

高嶺土是一種重要的粘土礦物，其本身具有優良的性能，被廣泛應用于陶瓷、造紙等多個行業中，這些行業對高嶺上的白度都有一定的要求[1-5]。影響高嶺土白度的主要因素是鐵、鈦的礦物成分與含量[6]，其中自由鐵雜質主要以鐵礦物形式存在，如褐鐵礦、赤鐵礦、磁鐵礦、黃鐵礦、菱鐵礦和黃鉀鐵礬等。這些鐵礦物會使高嶺土呈現不同程度的灰色、綠色、褐色、粉紅色等[7]，然而鐵雜質多數以Fe2O3的形式賦存于礦物顆粒中，由于Fe2O3對高嶺土的白度影響大，因此是首當其沖應被清除的雜質成分[8]。

高嶺土在工業利用之前一般都需要經過除鐵增白處理，除鐵方案和工藝路線，主要取決于高嶺土中鐵的賦存狀態及產品的最終用途。高嶺土除鐵增白方法主要有物理法[9-11]、化學法[12-14]、煅燒法和微生物法[8,15-16]。物理方法除鐵可使高嶺土白度有一定的提高，如磁選法可去除高嶺土中具有一定磁性染色物質[9]；化學漂白是利用特定的化學試劑選擇性溶解高嶺土中的雜質，然后通過洗滌、過濾除去雜質的方法。根據高嶺土原料中鐵的賦存形式，目前已形成了

礦物微生物加工作為一種新興技術正受到越來越廣泛的關注。目前高嶺土除鐵微生物主要有氧化亞鐵硫桿菌、黑曲霉菌、異養鐵還原菌等。氧化亞鐵硫桿菌可氧化高嶺土體系中的黃鐵礦[17]，從而提高高嶺土白度；黑曲霉菌產生的有機酸(主要是草酸)對高嶺土中難溶氧化鐵[18]有一定的溶解作用，達到了增白目的；鐵還原菌能使高嶺土中三價鐵(Fe2O3)還原成易溶于水的二價鐵離子而除去[8,16]。微生物法具有成本低、能耗少、環境污染程度輕等顯著特點，但其工業化瓶頸在于反應速度較慢，處理周期較長。隨著高嶺土礦的不斷開采，優質資源日益減少。因此，開展高嶺土微生物除鐵增白研究，可使原本開采價值不高的高鐵低品位高嶺土礦得以開采，實現礦產資源的可持續發展。

2　材料與方法

2.1 材料

2.1.1 分離樣品

采自福建礦山(高嶺土礦和錳礦)。

2.1.2 高嶺土

由龍巖高嶺土公司提供，Fe2O3含量為0.89%，含三價鐵為0.623%。

2.1.3 培養基

(1) PTYG上層固體培養基。

1%PTYG的上層固體培養基：蛋白胨0.10g、酵母膏0.10g、蔗糖0.10g、MgSO4·7H2O 0.60g、無水CaCl20.25g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，調節培養基pH值為7.0。上層PTYG固體培養基，用于營造厭氧環境。

(2) PTYG下層選擇性固體培養基。

檸檬酸鐵下層培養基：檸檬酸鐵銨0.10g、NH4C1 1.00g、無水CaCl20.25g、MgSO4·7H2O 3.00g、 K2HPO4·3H2O 3.60g、KH2PO46.25g、葡萄糖50g、瓊脂20g、蒸餾水1 000mL，調節培養基pH值為7.0。

(3) LB培養基。

LB培養基：蛋白胨10g、牛肉膏5g、NaCl 5g、蒸餾水1 000mL，調節培養基pH值為7.0，121℃滅菌20min。固體培養基每升加20g的瓊脂。

(4) 高嶺土培養基。

高嶺土培養基：高嶺土100g、葡萄糖10g、酵母膏1g、蒸餾水1 000mL，pH值自然。

2.1.4 主要儀器

潔凈工作臺(SW-GF-1F型，上海博訊實業有限公司醫療設備廠)；生化培養箱(SPX-2508-Z型，上海博迅實業有限公司醫療設備廠)；光學顯微鏡(PM-10AD型，Olympus)；恒溫搖床(HQ45型，武漢科學儀器廠)；滅菌消毒器(CRDX-280型，上海電安醫療器械廠)；分光光度計(723型，上海精密科學儀器有限公司)；臺式離心機(TDL-40B-II型，上海安亭科學儀器廠)；冷凍高速離心機(CS-15R型，Beckman)；智能白度測定儀(WSB-VI型，杭州大吉光電儀器有限公公司)。

2.2.1 富集培養

稱取樣品10g于250mL三角瓶中，加入1g葡萄糖，100mL水，于30℃靜置富集培養至高嶺土由紅色變為白色。取5mL培養液接種于LB培養基中，于30℃靜置培養1d，作為接種液。將此接種液接入裝有高嶺土培養基瓶中，再通氮氣去除瓶中氧氣，加蓋密封，30℃暗光厭氧培養至高嶺土由紅色變為白色，進行鐵還原菌選擇性培養，如此重復多次，淘汰非還原性細菌，最終獲得純度較高的鐵還原菌混合菌液。

2.2.2 鐵還原菌的分離純化

采用稀釋涂布法，即分別取不同稀釋度上述鐵還原菌混合菌液各1mL，涂布于檸檬酸鐵固體培養基平板上，覆蓋一層PTYG上層培養基，于30℃培養，3d后觀察微生物生長情況和菌落形態。挑取不同形態的菌落接種至LB培養基斜面，分別測定其使高嶺土除鐵的能力，選擇一株除鐵能力較強的菌株用于菌種鑒定。

2.2.3 菌株鑒定

(1) 形態特征和生理生化特征。

綜上所述，在經濟全球化日益復雜的背景下，通過有效的內部控制管理能夠提升企業抵御財務風險的能力，實現企業的長遠發展。為此，針對當前基于財務風險防范的內部控制管理存在的問題，需要相關人員從思想意識提升、制度完善、環境營造等方面積極思考怎樣優化企業內部控制管理，以期能夠更好的促進現代企業發展。

參照《伯杰氏細菌鑒定手冊》[19]和《常見細菌系統鑒定手冊》[20]對分離純化后的的鐵還原菌進行形態特征和生理生化特征鑒定。

(2) 菌株的16S rDNA分子鑒定。

基因組DNA提取及PCR擴增操作按試劑盒使用說明書進行，試劑盒產品編號NEP021-1。

基因組DNA提?。翰捎秒x心柱型細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌液基因組DNA。

16S rDNA的PCR擴增體系：DNA 2μL、2× MIX 25μL、MF 1μL/10μm、MR 1μL/10μm、ddH2O 50μL。

PCR反應為：94℃預變性5min；94℃ 30s，52℃30s，72℃ 100s，共30個循環；最后在72℃延伸10min。PCR反應產物用10g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR擴增產物由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司進行DNA測序。

(3) 構建系統發育樹。

將菌株FeRB-FL1404的16S rDNA基因序列測定結果輸入GenBank進行序列相似性比對，獲得的序列提交NCBI進行BLAST比對，并將所選擇出的同源性較高的序列，采用DNAstar7.0軟件中的Jotun Hein Method構建系統進化樹。

2.2.4 FeRB-FL1404菌對高嶺土中Fe2O3(Fe3+)的還原

鐵還原菌液制備：鐵還原菌接入LB培養基中，于28℃培養36h(對數生長期)得到鐵還原菌液，調節菌液OD600為0.2，用于試驗。

批試驗為在250mL的錐形瓶中加入高嶺土10g，選用4種不同碳源(葡萄糖、蔗糖、草酸鈉和檸檬酸三鈉)，加量均為1g，pH值調至6.5、蒸餾水100mL，滅菌后，加入5mL鐵還原菌液，28℃厭氧培養10d，離心后測定溶液中Fe2+的含量，計算高嶺土Fe3+去除率。試驗平行3次，取平均值。

2.2.5 Fe2+濃度的測定

采用鄰菲啰啉分光光度法[21]測定溶液中Fe2+濃度。從100mL培養液中取3mL，3 500r/min離心5min，取0.2mL上清液至25mL的比色管中，再加入鹽酸羥胺1mL、NaAc-HAc緩沖溶液5mL、鄰菲啰啉3.0mL，加水至刻線，顯色10min，在510nm處測吸光度，根據工作曲線，計算出高嶺土中鐵的還原量和去除率。

式中：CFe(Ⅱ)——高嶺土中鐵的去除量，mg/g；

a——稀釋倍數；

y——0.2mL中Fe2+濃度，μg/mL；

V——培養液總體積，mL；

m——高嶺土量，g。

高嶺土原礦含Fe2O30.89%，經換算，相當于高嶺土含Fe3+(Fe2O3)：

CFe(Ⅲ)＝6.23mg Fe/g高嶺土；

通過測定溶液中Fe2+的含量，計算出CFe(Ⅱ)，則：

高嶺土Fe3+(Fe2O3)去除率=CFe(Ⅱ)/CFe(Ⅲ)×100%

3　結果與討論

3.1 鐵還原菌的分離

采用高嶺土為富集培養基，PTYG-檸檬酸鐵雙層培養基為選擇性分離培養基，從錳礦樣品中分離出1株異化鐵還原菌FeRB-FL1404菌株。

3.2 鐵還原菌的鑒定

3.2.1 培養特性

鐵還原菌FeRB-FL1404在LB培養基上28℃培養24h后，形成菌落為白色至淡黃色，橢圓形，菌落光滑，邊緣整齊。

3.2.2 染色特性

經革蘭氏染色，顯微鏡(×1000)觀察，結果見圖1。由圖1可以看到，該菌株菌體呈桿狀，大小約(0.6～0.7)μm×(2.0～3.0)μm，菌體呈紫色，為革蘭氏陽性細菌。

圖1　鐵還原菌FeRB-FL1404的菌體形態

3.2.3 生理生化特征

該菌具有過氧化氫酶活性，能還原石蕊牛奶，分泌蛋白酶分解明膠，分解葡萄糖產酸而不產氣，無精氨酸雙水解酶，V.P.試驗陽性，硫化氫試驗陽性，硝酸鹽還原陰性，淀粉水解陰性，M.R試驗陰性。

3.2.4 菌株16S rDNA序列比對及系統發育樹構建

以菌株FeRB-FL1404基因組DNA為模板，經PCR擴增后在10%的瓊脂糖凝膠上電泳，結果如圖2所示(圖中I表示:16S rDNA PCR產物；M表示：DAN Marker)，在約1 500bp處有一明亮的條帶。

圖2　鐵還原菌FeRB-FL1404基因組的PCR擴增產物電泳

將該序列提交到GenBank上進行BLAST比對分析，該菌與短小芽孢桿菌具有較高的同源性，在進化關系上，菌株FeRB-FL1404與Bacillus屬的Bacillus pumilus同源性高達99%。構建的系統進化樹如圖3所示。

圖3　菌株FeRB-FL1404基于16S rDNA序列系統發育樹

綜合形態特征、生理生化特征和16S rDNA序列分析結果，可確定鐵還原菌FeRB-FL1404為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

3.3 鐵還原菌對高嶺土中Fe2O3(Fe3+)的還原

為了使在較短的時間內獲得較多的活性較高的菌體，對FeRB-FL1404鐵還原菌的最適生長溫度和生長曲線進行測定，使培養得到的菌體能更加有效地還原高嶺土中Fe2O3(Fe3+)。

3.3.1 溫度對菌體生長的影響

FeRB-FL1404菌用LB培養基分別在22、24、26、28、30、32℃于120rpm恒溫振蕩培養48h，在600nm波長處，測定培養液OD600值，結果如圖4。從圖4可看出，該菌最適生長溫度為28℃，因此，后續試驗溫度取28℃。

圖4　溫度對菌體生長量的影響

3.3.2 鐵還原菌生長曲線

在一批含5mL LB培養基的試管中各接入0.5mL鐵還原菌種子液，于28℃、120rpm恒溫振蕩培養，每隔3h取三根試管，測定培養液OD600值，取3次平均值，繪制生長曲線見圖5。

從圖5可知鐵還原菌14～04接種后0～30h為延滯期，30～48h為對數生長期，48h以后為穩定期。由于在對數生長期，菌體活力最佳，因此在后續試驗中選擇培養36h鐵還原菌作為接種液。

3.3.3 碳源對高嶺土中Fe2O3(Fe3+)還原的影響

鐵還原菌在厭氧條件下生長，并以葡萄糖等有機物為電子供體，以高嶺土中Fe3+(Fe2O3)為電子受體進行異化鐵還原作用，可將高嶺土Fe3+還原為可溶性的Fe2+從礦物中浸出，所以可用培養液中Fe2+增加量來表示高嶺土中Fe3+的去除量，從而計算出其去除率。

試驗礦漿濃度為10%，OD600值為0.2的鐵還原菌液加量為5%，碳源加量為1%，pH值為6.5，在此條件下厭氧培養10d，考察不同碳源對高嶺土中Fe2O3(Fe3+)還原的影響，結果如圖6所示。

圖5　鐵還原菌生長曲線

圖6　不同碳源對微生物還原Fe(Ⅲ)的影響

圖6表明以葡萄糖、蔗糖、草酸鈉和檸檬酸三鈉為碳源，鐵還原菌FeRB-FL1404均能還原高嶺土中Fe3+，高嶺土中Fe3+的去除量依次為2.87、1.19、2.52、1.68mg/g，去除率依次為46.07%、19.10%、40.45%和26.97%，高嶺土中Fe2O3含量從原土的0.89%依次降低到0.48%、0.72%、0.53%和0.65%。其中以葡萄糖為碳源除鐵效果最好，除鐵后高嶺土中的Fe2O3含量降到0.48%，相應提高了高嶺土白度，經白度檢測儀測定，高嶺土自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%，白度提高顯著。

4　結論

(1) 采用富集培養方法，以高嶺土為富集培養基，從錳礦樣品中分離到一株能夠還原高嶺土中Fe(Ⅲ)的鐵還原菌FeRB-FL1404。其菌落特征為：白色至淡黃色，圓形，邊緣整齊。染色結果表明，該菌株為革蘭氏陽性細菌，桿狀，大小約(0.6～0.7)μm× (2.0～3.0)μm。

(2) 采用PCR技術獲得了1 500bp的鐵還原菌株FeRB-FL1404的部分16S rDNA序列。經同源性分析和與相關菌株16S rDNA的系統進化關系比較發現，菌株FeRB-FL1404與Bacillus屬的Bacillus pumilus同源性高達99%，結合形態特征和生理生化特征，該菌株可確定為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)。

(3) FeRB-FL14043菌分別以葡萄糖、蔗糖、草酸鈉、檸檬酸三鈉為碳源，其均能使高嶺土中Fe3+還原，但葡萄糖除鐵效果最好；以葡萄糖為碳源，高嶺土中Fe3+去除率為46.07%，Fe2O3含量由0.89%降低至0.48%，自然白度由61.3%提高至68.7%，1 280℃燒成白度由84.9%提高至90.6%。

【參考文獻】

[1]SARMA J, GANGULY M. Catalytic activity of natural kaolinite clay of karbi-anglong district of assam[J]. Chem. Chem. Eng. 2011(5):1116-1121.

[2]MURRAY H H. Traditional and new applications for kaolin, smectite, palygorskite: a general overview[J]. Appl. Clay Sci., 2000,17: 207-221.

[3]LIEW Y M, KAMARUDIN H, MUSTAFA A M et al. Investigating the possibility of utilization of kaolin and the potential of metakaolin to produce green cement for construction purposesa review aust[J]. Basic & Appl. Sci., 2011, 5(9): 441-449.

[4]SAIKIA N, BHARALI D, SENGUPTA P, et al. Characterization, beneficiation and utilization of a kaolinite clay from Assam, India[J]. Appl. Clay Sci., 2012,24:93-103.

[5]陳文瑞.我國陶瓷超級高嶺土的開發與應用[J].中國陶瓷,2008, 44(11):59-62．

[6]BEROLINO L C, ROSSI A M, SCORZELLI R B, et a1.Influence of iron on kaolin whiteness: An electron paramagnetic resonance study[J]. Appl. Clay Sci., 2010, 49(3): 170-175.

[7]于瑞敏.過渡金屬氧化物及化學漂白工藝對高嶺土白度影響規律的研宄[D].廈門:廈門大學,2008．

[8]LEE E Y, CHO K S, RYU H W. Microbial refinement of kaolin by iron-reducing bacteria[J]. Appl. Clay Sci., 2002(22): 47-53.

[9]CHEN L Z, LIAO G, QIAN Z H, et al. Vibrating high gradient magnetic separation for purification of iron impurities under dry condition[J]. Int. J. Mine. Proc., 2012, 102(25): 136-140.

[10]XIA L Y, ZHONG H, LIU G Y, et al. Comparative studies on flotation of illite, pyrophyllite and kaolinite with Gemini and conventional cationic surfactants[J]. Transactions of Nonferrous Metals Society of China, 2009, 19(2): 446-453.

[11]XIA G H, LU M, SU X L, et al. Iron removal from kaolin using thiourea assisted by ultrasonic wave[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2012, 19(1): 38-42.

[12]TUNCUK A, CIFTLIK S, AKCIL A. Factorial experiments for iron removal from kaolin by using single and two-step leaching with sulfuric acid[J]. Hydrometallurgy, 2013, 134: 80-86.

[13]GONZáLEZ J A, RUIZ M D C. Bleaching of kaolins and clays by chlorination of iron and titanium[J]. Appl. Clay Sci., 2006, 33: 219-229.

[14]MUSIAL I, CIBIS E, RYMOWICZ W. Designing a process of kaolin bleaching in an oxalic acid enriched medium by Aspergillus niger cultivated on biodiesel-derived waste composed of glycerol and fatty acids[J]. Appl. Clay Sci., 2011, 52(3): 277-284.

[15]GUO M R, LIN Y M, XU X P, et al. Bioleaching of iron from kaolin using iron-reducing bacteria with various carbon nitrogen sources[J]. Appl. Clay Sci., 2010, 48: 379-383.

[16]何秋香,郭敏容,陳文瑞,等.影響高嶺土中Fe(Ⅲ)生物還原的因素[J].礦物學報,2011,31(2):296-301.

[17]雷紹民,龔文琪,袁楚雄.微生物浸出煤系高嶺土中黃鐵礦的初步研究[J].武漢工業大學學報,2000,22(2):8-10．

[18]HOSSEINI M R, PAZOUKI M, RANJBAR M, et al. Bioleaching of iron from highly contaminated Kaolin clay by Aspergillus niger[J]. Appl. Clay Sci., 2007(37): 251-257.

[19]布坎南 R E, 吉本撕 N E.伯杰細菌鑒定手冊[M].北京:科學出版社,1994.

[20]東秀珠,蔡妙英.常見細菌系統鑒定手冊[M].北京:科學出版社,2001.

[21]國家環境保護總局編委會.水和廢水監測分析方法(第4版)[M].北京:中國環境科學出版社,2002:368-370.

【試驗研究】

Study on the Isolation and Identification of A Iron-reducing Bacterium FeRB-FL1404 and the Fe(Ⅲ) Removal of Its From Kaolin

LIN Yu-man1, CHEN Xiao-lan2, WEI Zhao-di3, XU Xu-ping2
(1.College of Environmental Science and Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 2.College of Life Sciences, Fujian Normal University, Fuzhou 350007, China; 3.College of Chemistry and Chemical Engineering, Fujian Normal University, Fuzhou 350007,China)

Abstract:In this paper, kaolin was chosen as the selective media. A iron-reducing bacterium FeRB-FL1404 was isolated from manganese ore and was identified as Bacillus pumilus according to its morphology feature, physiological and biochemical characteristics and 16S rDNA analysis. In addition, carbon souses, including glucose sucrose sodium oxalate trisodium citrate,impacting on the iron removal from kaolin using ion reducing bacteria were investigated with batch experiments. The results showed that glucose emerged as the most effective carbon source. Under the conditions with glucose as carbon source, glucose concentration of 1%, pulp concentration of 10%, bacterial inoculum for 5%, temperature of 28℃, pH6.5, anaerobic culture for 10 days, the removal percentage of Fe(3+)from kaolin was achieved 46.07%, Fe2O3content in kaolin was reduced from 0.89% to 0.48%, the natural whiteness was enhanced from 61.3% to 68.7%, and whiteness was enhanced from 84.9% to 90.6% after fired at 1 280℃.

Key words:iron-reducing bacteria; isolation; kaolin; removal of iron; carbon source

【收稿日期】2014-08-27

【基金項目】福建省自然科學基金項目(2012J01198)；福建省高校產學合作科技重大項目(2014H6008)。book=12,ebook=15氧化漂白法、酸浸漂白法、還原漂白法、氧化—還原聯合法等，其中以還原漂白法應用最為普遍。高嶺土中鐵雜質多為難溶于水的三價鐵，一般采用在還原劑的作用下還原漂白法去除；高溫煅燒是除碳增白的最佳方法，但對于鐵含量較高的高嶺土礦，煅燒后的白度難以突破85%。

【文章編號】1007-9386(2015)01-0011-05

【文獻標識碼】A

【中圖分類號】TD925.5；TD973.2