不同抗寒冬油菜品種過氧化物同工酶比較

次仁白珍

(西藏自治區農牧科學院農業研究所·西藏拉薩·850032)

不同抗寒冬油菜品種過氧化物同工酶比較

次仁白珍*

(西藏自治區農牧科學院農業研究所·西藏拉薩·850032)

本文利用聚丙烯酰胺凝膠電泳分析了8份白菜型冬油菜的過氧化物酶同工酶的特性。結果表明:天油類與隴油類在逆境損傷下酶譜含量差異較大,隴油類的酶譜含量均高于天油類;天油類不同種間酶譜特征基本相同,而隴油類相比天油類而言,酶譜間均存有較大的差異。這說明隴油類的過氧化物同工酶抗逆性生理作用高于天油類。

油菜 過氧化物同工酶 聚丙烯酰胺凝膠電泳

冬油菜是我國北方地區重要的油料作物之一,對北方地區國民經濟和農業生產具有深遠意義。我區冬季晝夜溫差大,甘藍型冬油菜在我區種植很難成活,自引進白菜型冬油菜種植后,改變我區自10月份后耕地一片光禿現象,冬油菜的引種,不僅提高土地的利用效率和復種指數,同時還起到保護生態的作用,因此冬油菜的抗寒性至關重要。在生物學系統中常用形態學差異和特征,不能準確區分趨向同類還是本身同源,加之進化速度不穩定,穩定性也差,但如果提供數量足夠的植物蛋白質用來順序分析不僅困難增加,且耗資增大。因此應用同工酶技術可以簡單可行的進行鑒別。

同工酶技術,是指用凝膠電泳的方法,將不同的同工酶酶譜帶分離,經過染色形成深淺不一的酶帶譜。已經成為作物物種起源、生長發育、遺傳育種等相關領域的一項重要的研究工具,同時也可被用來鑒定生物基因型是否存在差異的相關工具[1]。同工酶是由結構基因編碼,且同時能反映在酶譜上,具有明顯的種間、屬間、組織、發育階段的特異性[2-4]。到目前為主,植物組織研究最多的是過氧化物酶同工酶,即被稱為678同工酶。它在各種植物組織中普遍存在,是結構及生理性質不同的酶分子類型,但在生物體內催化反應作用相同,是基因表達的直接產物。在特定的生育期具有相對的穩定性和特異性,能夠從蛋白質方面對種群關系和遺傳變異進行相對客觀的分析和比較[5-6]。同工酶普遍存在植物器官,目前仍被廣泛利用的遺傳標記,主要從蛋白質水平上顯示種質資源或物種的遺傳多樣性。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳和相關的染色反應,顯示同工酶不同譜帶,用于不同物種、同一物種不同品種之間的遺傳差異鑒定,在物種特性和遺傳多樣性研究等領域有廣泛的用途[7-8]。本文對我區引種種植的8份白菜型油菜的POD同工酶進行電泳分析,討論POD同工酶經過冬天的逆境生理過程后酶譜的變化規律,為我區選育最合適的白菜型冬油菜種植及不同冬油菜的品種栽培、利用提供相關的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試劑

試驗材料:隴油系列類4份品種:隴油6號、隴油7號、隴油8號、隴油9號;天油系列類4份品種:天油5號、天油6號、天油7號、天油8號;于2013年8月在農科所試驗基地播種,第二年返青后開始試驗。

試驗試劑:Tris、Bis、TEMED、鹽酸、瓊脂甘氨酸、蔗糖、乙酸鈉、冰醋酸、過氧化氫、聯苯胺、核黃素、溴酚藍、抗壞血酸、去離子水等。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備:返青后在3-4葉期取完好葉片,自封袋封裝,冰壺帶回。先用清水沖洗,再用去離子水沖洗,干凈濾紙吸干表面水分后,將供試材料放于4℃冰箱12h保存。樣液提取,每份材料稱取葉片0.3 g,加3 m L同工酶提取液(即Tris12.0g,去離子水800ml,以HCl或者NaOH調節p H至7.8),加少許石英砂,冰浴研磨至勻漿。12000 r/min離心10 min,吸取上清液,分裝后-20℃冰箱保存備用,提取試驗3次重復。

1.2.2 制膠及電泳:采用聚丙烯酰胺雙向凝膠電泳技術,灌膠分為分離膠和濃縮膠,其中分離膠質量濃度為0.08 g/m L、p H8.0,且分離膠緩沖液Tris-HCl、p H=8.0;濃縮膠質量濃度為0.04 g/m L、p H6.5,且濃縮膠緩沖液Tris-HCl、p H=6.5,電極緩沖液用p H8.0的Tris-Gly,上樣量18-20μL,電泳過程采用恒壓進行,濃縮膠120 V電泳約1 h,分離膠180V電泳約4 h,待溴酚藍指示劑距離前沿膠底0.5 cm時,結束電泳。2-3次重復電泳試驗。

1.2.3 染色及記錄:電泳完畢后,先用乙酸緩沖液浸泡3min,然后倒去乙酸緩沖液,加抗壞血酸-聯苯胺染色液,使淹沒整個膠面,于搖床上顯色15-20min,待出現過氧化物同工酶的紅褐色酶譜。倒掉染色液,重新加入清水中觀察記載。酶帶記錄從溴酚藍前沿出現的第一條帶開始命名為某酶代號-1,以此類推[9]。

1.2.4 電泳遷移率及酶帶數的計算:同工酶譜帶按照從陰極到陽極(從電泳膠面的上到下)的方法進行數字編號,統計每個品種各自的酶帶數,計算各酶帶的相對遷移率。相對遷移率的計算公式如下:酶帶遷移率(Rf)=酶帶遷移距離/溴酚藍指示劑遷移距離[10]。同時按酶帶的顏色深淺、寬度、相對遷移率以及酶帶數繪制酶帶模式圖,標定酶帶位置.

2 結果與分析

圖1、圖2分別為8份白菜型油菜過氧化物酶同工酶電泳圖和電泳模式圖,由圖可以看出,不同抗寒類型的油菜電泳結果不同,品種間過氧化物酶的活性強度不同,出現的譜帶有3-5各不相同,同一類型如天油類差異不顯著,隴油類差異也不顯著,而不同類型間天油類的品種和隴油類的品種相比,差異較大。

圖1 8份白菜型油菜過氧化物酶同工酶電泳圖

圖2 8份白菜型油菜過氧化物酶同工酶電泳模式圖

表1顯示,天油類品種天油5號、天油6號、天油7號、天油8號的POD同工酶有Rf為0.38、0.51和0. 79的3條酶帶,其酶譜特征也基本相似,不僅表現在酶帶數目上一致,而且發現在電泳過程中酶帶的顯色速度較慢、顏色較淺、較窄和遷移速率較小。

隴油類品種隴油6號、隴油7號、隴油8號、隴油9號不同品種間的同工酶酶譜特征則存有差異,酶譜帶出現3-5的變化,其中共有Rf為0.38、0.51和0.79的3條酶帶。隴油6號有5條酶帶,增加了Rf為0.14、0.75的兩條酶帶;隴油7號有4條酶帶,增加了Rf為0.75的一條酶帶;隴油8號僅有3條共有酶帶;隴油9號有四條酶帶,增加了Rf為0.14的一條酶帶。其它的過氧化物酶帶型基本一致,只在表達量上有差別。

天油類與隴油類品種共有Rf為0.38、0.51和0.79的3條酶帶,但隴油類品種酶帶的顏色較深、顯色速度較快、酶帶較天油類品種寬,這可能是由于不同品種間在基因上、抗寒性的差異,從而導致了酶帶上過氧化物酶同工酶表達速度和表達量的差異。

表1 8份白菜型油菜過氧化物酶譜及相對遷移率

3 結論與討論

3.1 結論

過氧化物(POD)同工酶作為植物保護酶系的重要保護酶之一,與植物的抗寒、抗旱、抗鹽、抗病等方面的抗逆生理顯著相關。過氧化物同工酶帶的染色深淺、酶帶寬窄可以反映同工酶含量多少,本文通過對白菜型冬油菜的天油類和隴油類品種中過氧化物(POD)同工酶酶譜比較,可以看出隴油類過氧化物(POD)同工酶譜帶數、染色度均高于天油類,說明過氧化物(POD)同工酶在隴油類中的含量高于天油類。與天油類油菜品種相比,隴油類是強冬性冬油菜,能夠適應比較惡劣生活環境,因此,筆者認為隴油類品種的抗逆生理作用高于天油類品種的抗逆性生理作用,這為天油類和隴油類在抗逆性生理保護作用的比較提供了一定的生化依據,在西藏地區、尤其是相對高海拔地區選用隴油類冬油菜品種進行種植,能顯著提高油菜越冬率,增加成活性。

3.2 討論

逆境誘導是過氧化物(POD)同工酶發揮作用的前提條件,在逆境中過氧化物同工酶顯著提高有利于清除活性自由基氧,緩解不利環境和因素對植物自身構成的威脅,從而達到保護植物自身不被傷害目的。過氧化物同工酶也能反映不同品種間抗性和基因型的差異,但是不同人操作手法的差異也造成一定的誤差。酶帶隨著染色時間的拉長和染色不正當操作,均會染色不成功,相關文獻均有這方面的報道,但目前為止尚未找到解決這一問題的可行性策略,這可能是過氧化物酶同工酶染色時與冰醋酸揮發有很大關系,根據本文在試驗過程中的操作,建議在配置相同比例的丙酮∶水溶液時丙酮略多有助于改善染色效果。另外,過氧化物酶染色可適當采用適當高溫和搖床,染色效果會更佳。

[1]沙偉,孟凡玲,瑪昌軍.10個苜蓿品種過氧化物同工酶的分析[J].北方園藝,2007(1):150-152.

[2]陳默君,賈甚修.中國飼用植物志[M].北京:中國農業出版社,2002.

[3]任繼周.主要牧草栽培及種子生產[M].成都:四川科學技術出版社,1986.

[4]王保仁,常桂菊,胡能書,等.湘矮型油菜“三系“及其雜交種過氧化物酶同工酶的初步研究[J].湖南農業科技,1980,(6):162～1.

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[6]李殿榮,王保仁.同工酶譜分析鑒定雜交油菜秦油2號種子純度技術研究[J].陜西農墾科技,1992,2 (22):～28.

[7]劉忠松,官春云,陳社員.植物雄性不育機理的研究及應用[M].北京:中國農業出版社,2001.507～5.

[8]胡志昂,王洪新,閻龍飛$裸子植物的生化系統學(一)-松科植物的過氧化物酶[J]植物學報,1997 (4):423-430.

[9]王韶唐.植物理學實驗指導[M].西安:陜西科技出版社,1986.44-48.

[10]鄒春靜,盛曉峰,韓文卿,等.同工酶分析技術及其在植物研究中的應用[J].生態學雜志,2003,22 (6):63-69.

Compare the POD of the Several Campestrises Damaged by the Low Temperature

Ciren baizhen
(Tibet Autonomous Region of Agricultural Research Institute,Lhasa,850032)

Take advantage of the PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis of POD for 8 Species of campestris.The results indicated that:when the Tianyou and Longyou were damaged by low temperature.the difference of zymogram between the Tianyou and Longyou was obvious,the content of the Longyou were all exceed the Tianyou.The electrophoretograms of POD for four species of the Tianyou of the difference was lower,but the Longyou for four species had sharp distinction.The results state that stress tolerance of the the Tianyou was better than the Longyou.

campestris;peroxidase isozyme;PAGE polyacrylamide gelelectrophoresis

* 次仁白珍(1975-),女,藏族,副研究員。主要從事油菜栽培研究工作。聯系電話:13989088341