單點式位移平臺激光共聚焦掃描熒光顯微鏡

陶振強　賈南南　阮斌

摘要： 為了獲得細胞圖像，利用Visual Studio C#開發了移動位移平臺的控制程序，使用位移平臺單點掃描的方式設計激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope，LCSM）。為了獲得高分辨率的位移，位移由精度可以達到1 nm的壓電陶瓷驅動器驅動。設計了梳狀和矩形兩種掃描路徑，通過程序設計位移補償的方法彌補了機械運動的偏差。利用算術平均值的數字濾波方法處理數據采集卡采集的數據以減小隨機噪聲的影響。實驗結果證明，利用C#程序控制的單點式平臺掃描LCSM具有較好地測量效果。

關鍵詞： 共聚焦； 熒光顯微鏡； 數字濾波； 平臺掃描； C#程序控制； 位移補償

中圖分類號： Q 631文獻標志碼： Adoi： 10.3969/j.issn.10055630.2015.02.017

Singlepoint displacement of the platform laser confocal scanning

fluorescence microscope

TAO Zhenqiang， JIA Nannan， RUAN Bin

（School of OpticalElectrical and Computer Engineering， University of Shanghai for

Science and Technology， Shanghai 200093， China）

Abstract： In order to obtain cells image， we use Visual Studio C# to develop the control program of the mobile displacement platform， and use displacement singlepoint scanning way to design laser confocal scanning microscope （LCSM）. In order to obtain high resolution displacement， displacement of the platform with piezoelectric ceramic actuator is used and the highest accuracy can reach 1 nm. Both comb and rectangle scanning paths are designed， by programming the displacement compensation method to make up the mechanical movement deviation. Digital filtering arithmetic average method of dealing with the data acquisition card is used to collect data to reduce the influence of random noise. Experimental results show that singlepoint platform using C# program LCSM has a very good effect.

Keywords： confocal； fluorescence microscopy； digital filtering； displacement of the platform； C# control program； displacement compensation

引言激光共聚焦掃描顯微鏡[1]（laser confocal scanning microscope，LCSM）高度結合光、機、電、計算機和圖像處理等技術，使其在光學顯微領域具有極其重要的地位。與傳統的光學顯微鏡相比其具有很高的橫向和縱向分辨率[23]，光學切片式的測量方式可以觀測物體的三維結構。其優良的性能在半導體[4]、材料科學[5]、生物醫學[6]領域具有廣泛的應用。激光共聚焦掃描熒光顯微鏡是結合激光共聚焦掃描顯微鏡和激光誘導熒光成像技術[7]的用于觀察細胞內部結構的儀器。激光共聚焦掃描顯微鏡以光學共軛焦點（簡稱共焦）成像技術[8]為基礎，相比傳統的熒光顯微鏡最大的優點在于加上了掃描系統，通過掃描可以對物體進行三維動態檢測。掃描系統通常有兩種工作方法[9]：光束掃描和物體掃描。光束掃描就是被掃描物體不動光束運動；物體掃描就是被掃描物體運動光束不動。光束掃描的優點是掃描速度快、精度高；物體掃描的優點是視場大、光學畸變小。圖1激光共聚焦掃描顯微鏡原理圖

Fig.1Laser confocal scanning microscope principle1激光共聚焦掃描顯微鏡的原理激光共聚焦掃描顯微鏡采用共軛焦點技術，使用激光作為光源，被探測物體和探測器處于彼此對應的共軛焦點位置。如圖1所示，激光器發出的激光光束通過擴束鏡擴束形成平行度好、直徑合適的平行光束，此光束被二向色鏡反射后進入物鏡，被物鏡聚焦于載物臺上的被測物體（以細胞為例）上。被熒光染色的細胞受激光照射后發出另外一種波長的光，反向通過物鏡形成和入射光束平行的熒光平行光，熒光可以通過二向色鏡而不被反射。通過二向色鏡的熒光被透鏡聚焦，在焦點處放置有針孔，此處針孔的作用是濾除非焦點處熒光的雜散光，針孔處放置有光電倍增管（PMT）以接收熒光信息。光學儀器第37卷

第2期陶振強，等：單點式位移平臺激光共聚焦掃描熒光顯微鏡

2激光共聚焦掃描熒光顯微鏡的關鍵因素

2.1針孔大小的選擇PMT前方針孔大小的選擇對LCSM成像影響極大，有關針孔大小該如何確定的研究有許多[1011]，研究表明，當針孔直徑恰好等于一個愛里斑直徑時，探測器通過針孔接收的光能量最大，成像效果最好。愛里斑通過系統成像的直徑為D=β1.22λNA（1）式中：β為系統的放大倍率，即物鏡的焦距和透鏡焦距之比；λ為所用光波長；NA為物鏡數值孔徑。實驗所用的λ=405 nm，NA=0.95，β=40，由此可知愛里斑成像直徑約為20.8 μm。

2.2數字濾波處理方法LCSM成像數據是通過采集卡A/D轉換而來，通過采集卡把模擬信號轉換為數字信號。由于通過采集卡采集轉換的數據沒經過任何處理，會帶有許多干擾信號，噪聲較大。為了得到更好的數據使圖像更加清晰，就需要對采集的數據進行處理，以濾除干擾信號。數據處理方法多種多樣[12]，最常用的有算術平均值數字濾波、加權平均值數字濾波、滑動平均值濾波、中值濾波等。由于實驗中會有各種隨機干擾（隨機噪聲），實驗選用的是算術平均值數字濾波方法，按輸入的N個采樣數據xi（i=1，2，3，…，N），尋找y，使y與各采樣值間的偏差平方和最小，其公式為E=min∑Ni=1（y-xi）2（2）對式（2）求極值可得y=∑Ni=1xiN，該方法就是把N次采樣值相加，然后取其算術平均值為本次采樣值。實驗是通過C#編寫程序[13]對采集卡采集的數據進行處理，程序代碼如下：

sum=0；

{

for （int k=0；k

{

double[]data=reader.ReadSingleSample（）；讀取采集卡采集數據sum=sum+data[0]；對某一點所有數據進行累加

}

sampledata[i，columns -1 -j]= sum/GParameters.averages；i、j為行數和列數

}3位移平臺控制設計為了達到更好的實驗效果，使用PI公司生產的壓電陶瓷驅動的六軸納米位移平臺，型號是P562.6CD，x、y、z軸移動范圍均為200 μm，位移精確度為1 nm，完全可以滿足高分辨率的需求。采用單點掃描方法控制平臺移動，單點掃描就是把單一方向上的量程按要求分成等分點，位移平臺移動時在每一個點上停一下，同時采集卡在此采集數據，實驗采用每點采集1 000個數據，然后取平均值。

3.1掃描方式的選擇單點掃描可分為兩種掃描方式：梳狀波掃描和矩形波掃描。梳狀波掃描就是掃描沿著同一個方向進行，也就是說沿x軸的方向不變，x的起始點是一定的；矩形波掃描就是雙向來回掃描，也就是說沿著x軸方向在起點和終點來回交替變化。圖2、圖3分別是梳妝波、矩形波掃描的局部路徑圖。

圖2梳狀波掃描局部路徑

Fig.2Comb wave scanning path

圖3矩形波掃描局部路徑

Fig.3Rectangular wave scanning path

梳狀波掃描程序為：

for（int i=0；i

∥PI的y軸對應圖像的y（行數）

{

for（int j=0；j

∥PI的x軸對應圖像的x（列數）

{

goalPos[0]= goalPos[0]+x_grid；

}

∥移動PI臺到新的一行

goalPos[0]= GParameters.nowPos[0]；

∥x軸返回起始位置

goalPos[1]=goalPos[1]+y_grid；

∥y軸移動一個采集距離

}

矩形波掃描程序如下：

for（inti=0；i

{

if（（i+1）% 2 == 0）∥判斷奇偶行

{for（int j=0；j

-j*x_grid；}

}

else

{

for（int j=0；j

goalPos[1]=y_Initial+（i+1）*y_grid；∥y跳到新一行

3.2位置偏差的補償由圖2、圖3可以看出，掃描時位移臺移動和設計會有偏差，這是由于位移臺移動有加速和減速過程，所以采集卡在采集數據時就會有偏差，也就是說對于細胞上某一點（i，j）預期對應的下一點（i，j+1）可能由于位移臺移動時機械誤差的原因變成點（i，j+2），如圖4所示。這時可以在程序中彌補機械運動產生的位移偏差，增加代碼為：goalPos[0]=x_Initial+j*x_grid±n；其中n值隨實際情況選取，所得效果如圖5所示。

圖4實際帶有位置偏差的效果圖

Fig.4Position deviation圖5程序糾正的效果圖

Fig.5Correction by using program

4實驗結果圖6為所設計的實驗裝置圖?？紤]熒光效率，激光器使用的是波長為405 nm的半導體激光器，為了得到大視場范圍我們使用了數值孔徑為0.95的物鏡，本實驗所采用的樣品是老鼠的神經細胞，其平均尺寸約為10 μm。圖7為本實驗的掃描細胞效果圖，由圖像可以看出，用Visual Studio C#程序控制的掃描對于細胞的掃描成像具有很好的效果。

圖6實驗裝置圖

Fig.6Experimental setup圖7掃描細胞成像圖

Fig.7Cell image5結論影響激光共聚焦掃描熒光顯微鏡系統圖像質量的因素有很多，比如光路搭建是不是共軸，數據采集卡的增益系數穩定性，光電倍增管（PMT）的驅動電源的電流電壓值是否穩定等等，若要得到好的實驗效果需要綜合考慮這些因素。參考文獻：

[1]田明麗，包正康，劉昱.激光共焦掃描顯微鏡及其應用[J].光學儀器，2001，23（1）：1619.

[2]霍霞，呂建勛，楊仁東，等.激光共聚焦顯微鏡與光學顯微鏡之比較[J].激光生物報，2001，10（1）：7679.

[3]SHEPPARD C J R，WILSON T.Depth of field in the scanning microscope[J].Optics Letters，1978，3（3）：115117.

[4]曾毅波，蔣書森，黃彩虹，等.激光共焦掃描顯微鏡在微機電系統中的應用[J].光學 精密工程，2008，16（7）：12411246.

[5]方園，梁高飛，朱光明，等.共焦激光掃描顯微鏡及其在鋼鐵相變原位觀察中的應用[J].寶鋼技術，2006（6）：6469.

[6]于彥華，邢達.激光共焦掃描顯微鏡及其在生物醫學中的應用[J].激光雜志，1999，20（6）：3538.

[7]高少佳.激光誘導熒光技術及其在生物儀器中的應用[D].杭州：浙江大學，2005：1320.

[8]王錫文，張果，楊春梅.共聚焦點成像技術[J].西南石油學院學報，2004，26（5）：1013.

[9]張景和，袁雅珍，阮錦.激光掃描顯微鏡中的掃描系統[J].光學 精密工程，1995，3（2）：6265.

[10]GE H Y，WANG B H，REN Q S.Influence of detector on resolution in confocal imaging system[J].Acta Photonica Sinica，2006，35（4）：587590.

[11]WILSON T，CARLINI A R.Size of the detector in confocal imaging systems[J].Optics Letters，1987，12（4）：227229.

[12]伍杰靈.數據采集系統中數字濾波算法的研究[D].北京：北京林業大學，2010：1525.

[13]魏汪洋，靳鯤鵬.C#從入門到精通[M].北京：化學工業出版社，2011：32133.

（編輯：劉鐵英）