三球懸鈴木果球離體培養與再生體系的建立*

崔明珠，張娜娜，田保明，李云玲，劉世超，曹剛強，位芳

(鄭州大學生命科學學院，河南 鄭州 450001)

懸鈴木 (Platanus orientalis)為懸鈴木科 (Platanaceae)懸鈴木屬 (Platanus)落葉大喬木，原產于東南歐、印度及美洲，屬下約7種。中國引入栽培3種，分別為一球懸鈴木 (P.occidentalis Linn.)、二球懸鈴木 (P.acerifolia Willd.)、三球懸鈴木。三球懸鈴木又名法國梧桐，樹姿優美，冠大蔭濃，遮蔭效果良好，是著名的行道樹;可吸塵、抗菌、凈化空氣，是良好的園林綠化樹種，且其木材也可用作建筑和家具用材［1］。

目前，國內外已對多種園林綠化木本植物的離體植株再生和育種進行過研究，有關懸鈴木再生體系的研究也有多篇報道，鄒永梅等［2～3］、蔡曉明等［4］、Tao等［5］、Sun 等［6］分別以當年生枝條、2－3年生枝條和葉片為外植體建立了北美一球懸鈴木植株再生體系，查向浩等［7］、王磊等［8］、李思等［9］、Li等［10］、劉國鋒等［11～13］分別以二球懸鈴木的單芽莖段、葉片及下胚軸為起始外植體進行不定芽的誘導，建立了植株再生體系。其中，供試材料基因型及外植體來源較為復雜，且鮮有三球懸鈴木再生體系［14～15］的報道。鑒于此，本實驗以三球懸鈴木成熟果球為材料，探討了不同消毒方式、無機鹽濃度對其種子萌發的影響，以及葉齡、光照對葉片愈傷組織誘導和植物生長調節劑濃度對不定芽分化的影響，初步建立三球懸鈴木果球離體培養技術及高效的葉片再生體系，以期為促進三球懸鈴木離體植株再生和苗木的推廣提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鄭州大學校園內生長健壯的6年生三球懸鈴木的成熟果球。

1.2 實驗方法

1.2.1 種子消毒

剝離果球中的種子，先用自來水沖洗1 h，再用含洗滌劑的溶液揉洗10 min，然后用自來水沖洗干凈。用無菌濾紙吸干種子表面水分后，先用75%乙醇浸泡30 s，然后用含少量Tween-20的10%H2O2進行不同時間 (5 min、10 min、15 min、20 min)的消毒處理，然后將種子分別播種于EX培養基(與李思等［9］的種子無菌萌發培養基成分相同)和MS［16］培養基中，光照培養 (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)45天后，觀察無菌苗的生長狀況，統計種子的萌發率和污染率，分析消毒時間、無機鹽濃度對無菌苗種子萌發的影響。萌發率=(萌發種子數/種子總數)×100%，污染率=(污染種子數/種子總數)×100%。每次處理統計30粒種子，重復3次。

1.2.2 愈傷組織誘導

將不同葉齡 (20天、30天、40天、50天、60天)的三球懸鈴木無菌苗葉片，用解剖刀去掉葉尖及葉柄，在遠軸面輕輕地劃3刀，遠軸面向下，分別接種于愈傷誘導培養基 (MS+IBA 0.1 mg/L+KT 1.0 mg/L+6-BA 1.5 mg/L)上，先在25℃黑暗條件下培養7天，再轉入光照培養 (光照強度1 500 Lx、光周期 16時/天、溫度 25℃)。其中，葉齡40天的葉片，光照條件設2個處理:A為直接光照培養;B為黑暗培養7天后，轉入光照培養。每2周繼代1次。30天后，統計葉片的愈傷組織誘導率，分析葉齡和光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響。愈傷組織誘導率=(出愈外植體數/接種總外植體數)×100%。每次處理統計25個外植體，重復3次。

1.2.3 不定芽分化

誘愈培養30天后，將40天葉齡的經暗培養處理的葉片愈傷組織分別接種于分化培養基 (MS基本培養基，添加 0.1～1.0 mg/L IBA、0.1～1.0 mg/L KT、0.5～1.5 mg/L 6-BA，蔗糖 30 g/L，瓊脂6 g/L，pH值5.8)上，光照培養 (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)。每2周繼代1次。30天后，統計葉片愈傷組織的不定芽分化率，分析植物生長調節劑濃度對葉片愈傷組織不定芽分化的影響。不定芽分化率=(出芽愈傷數/接種總愈傷數)×100%。每次處理統計20塊愈傷組織，重復3次。

1.2.4 壯苗培養

待不定芽長至3～5 cm，于超凈工作臺中，用解剖刀將不定芽連帶少許愈傷組織單個切下，繼代于新鮮的分化培養基上，繼續光照培養 (光照強度1 500 Lx、光周期16時/天、溫度25℃)。

1.3 數據分析

利用Excel 2007統計分析作圖，并采用SPSS 21.0進行方差分析。

2 結果與分析

2.1 三球懸鈴木果球離體培養和無菌苗的獲得

2.1.1 污染問題

在培養初期，因三球懸鈴木種子較小，果毛較多，種皮較厚，利用常規的消毒方法 (0.1%HgCl2消毒10 min和 10%NaClO消毒20－30 min)消毒后，萌發過程中仍污染嚴重，即使延長消毒時間，污染仍然嚴重，且由于消毒劑對種子長時間的毒害作用，導致種子萌發率低，無菌苗長勢差，生長緩慢，褐化嚴重，阻止了離體培養無菌苗在短時間內的獲得，成為系統構建三球懸鈴木再生體系的重大障礙。H2O2毒性較小，且低濃度有打破種子休眠作用。圖1表明，使用H2O2作為消毒劑，隨著消毒時間的增加，種子污染率下降，萌發率也隨之降低，當消毒時間為10 min時，可在不影響萌發率的前提下將污染率降到最低，且無菌苗長勢較好，組培苗無褐化現象。

圖1 H2O2不同消毒時間對三球懸鈴木種子污染率和萌發率的影響注:圖中同組數據字母完全不同時，表示在P﹤0.05水平差異顯著，下同。Fig.1 Effect of sterilization time on seed contamination rate and germination rate of mature fruit seeds

2.1.2 種子萌發培養基的篩選

N是構成蛋白質的重要元素，K是細胞的生化反應緩液，兩者均是植物細胞正常生長的必需元素之一。不同的植物或同一植物的不同外植體的最適用量不同。本實驗三球懸鈴木的萌發培養基為EX和MS培養基，二者無機鹽含量不同 (表1)。

表1 MS和EX培養基中部分大量元素的濃度配比Tab.1 The concentration ratio of a part of macronutrien in the MS and EX medium mmol·L－1

圖2 不同培養基的無菌苗萌發注:a為MS培養基上萌發的無菌苗;b為EX培養基上萌發的無菌苗Fig.2 Mature fruit seeds germinated on different media

圖2表明，在含低鹽成分的EX培養基上萌發的無菌苗葉片翠綠、健壯;而在含高鹽成分的MS基本培養基上萌發的無菌苗葉片發黃、瘦弱。故EX培養基可選作三球懸鈴木種子萌發的培養基。

2.2 三球懸鈴木葉片愈傷組織的誘導

2.2.1 葉齡對葉片愈傷組織誘導率的影響

研究表明［9～12］，較幼嫩的外植體容易脫分化形成愈傷組織，再分化形成芽，可獲得較高的再生率。不同葉齡三球懸鈴木葉片愈傷組織的誘導結果見圖3。從圖3可知，葉齡為30天以下及50天以上的葉片，其愈傷組織誘導能力明顯低于30－50天葉齡的葉片;30－50天葉齡的葉片較易形成愈傷組織，且40天葉齡的葉片愈傷組織誘導率最高，可達89.33%。生長初期的低齡葉片，體積較小，接種后易卷曲，褐變而死亡;而苗齡增大到一定程度，葉片柔嫩度降低，纖維含量增大，組培苗逐漸木質化，愈傷組織誘導率降低，分化能力也隨之下降。

圖3 葉齡對三球懸鈴木葉片愈傷組織誘導率的影響Fig.3 Effect of explant age on leaf callus induction rate

2.2.2 光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響

George等［17］認為黑暗條件下，可減少外植體酚類物質的釋放，減輕褐化，從而利于再生。黑暗和光照條件下，三球懸鈴木葉片愈傷組織誘導結果見圖4。由圖4可知，光照條件對三球懸鈴木葉片的脫分化很重要，暗培養能顯著促進愈傷組織的形成。黑暗培養7天后葉片葉脈處開始明顯膨大，能夠快速形成青綠色、淡黃色或紅褐色的緊實、生長狀態良好的愈傷組織 (圖5b);直接光照培養的葉片則容易干枯、褐化，較難形成愈傷組織，且形成的愈傷組織脆化，延長培養時間，很容易死亡。經過黑暗培養的葉片愈傷組織誘導率比光照培養的葉片高出約30.67%。

圖4 光照條件對葉片愈傷組織誘導率的影響Fig.4 Effect of light on leaf callus induction rate

圖5 三球懸鈴木離體植株再生注:a為種子萌發培養45天后的無菌苗;b為葉片葉脈處膨大，形成愈傷組織;c為葉片愈傷組織分化出叢生芽;d為不定芽壯苗培養后，形成單棵植株Fig.5 In vitro plantlet culture and shoot regeneration

2.3 三球懸鈴木葉片愈傷組織不定芽的分化

植物生長調節劑配比對葉片愈傷組織的不定芽分化影響大。由表2可知，各組合均能使葉片愈傷組織分化出不定芽。不同濃度的IBA對不定芽的分化存在差異。IBA濃度為0.1 mg/L時，不定芽分化率高，隨著IBA質量濃度的增大，不定芽分化率明顯降低。本實驗最終以添加IBA 0.1 mg/L、KT 1.0 mg/L和6-BA 1.5 mg/L的培養基作為三球懸鈴木組培苗的分化培養基，其不定芽分化率為66.67%。愈傷組織在轉到分化培養基上后，便開始分化出不定芽，隨著培養時間的延長，不定芽數量增多，單生芽增殖為叢生芽 (圖5c)。

表2 不同植物生長調節劑濃度對葉片愈傷組織不定芽分化率的影響Tab.2 Effect of different hormone combinations on adventitious bud induction

3 結論與討論

選擇合適的外植體是建立再生體系的重要前提。植物不同時期、不同部位、不同來源的材料都可以作為再生體系建立的外植體。懸鈴木的再生多以當年生枝條［2，7～8］、2－3 年生枝條［6］、葉片［14～15，18］和下胚軸［12］為外植體，但當年生或2－3年生枝條的取材易受季節限制，而下胚軸又不易大量獲得。三球懸鈴木果球成熟后，可長期保存，本實驗采用無菌苗葉片作為再生外植體，將成熟果球上剝離的種子用75%乙醇浸泡30 s，含少量Tween-20的10%H2O2消毒10 min后，播種于低鹽成分的EX培養基上，可明顯提高其種子的萌發率，為組織再生提供大量的外植體。用10%H2O2消毒處理時，時間過短，種子污染率大，時間過長，種子的萌發率急劇下降，因此選擇合適的消毒時間 (10 min)，才能在保證萌發率的前提下降低污染，該結果與周曉玲等［18］的研究相似。周曉玲等［18］還發現，降低MS用量對二球懸鈴木幼苗玻璃化有很好的防止作用，且幼苗粗壯，枝條高。本研究分別以低鹽培養基EX和高鹽培養基MS進行三球懸鈴木無菌幼苗的萌發實驗，也得到了相同的結果，降低無機鹽含量，三球懸鈴木無菌苗生長狀況更佳，葉片翠綠、健壯。

不同葉齡的葉片，木質化程度不同，通常，較幼嫩的外植體容易脫分化，也容易再分化形成不定芽，可以得到比較高的出芽率。在本研究中，葉齡為20天和60天的葉片，愈傷組織誘導率明顯低于30－50天葉齡的外植體，且以40天最高，這與王磊等［8］的研究結果葉齡35－60天的二球懸鈴木試管苗葉片適于再生，40天分化率最高相同。光照條件對葉片的脫分化有重要影響，葉片先經過7天的黑暗培養，再轉入光照培養，愈傷組織誘導率比直接光照培養的高約30.67%，且愈傷組織致密、生長狀態良好，不易褐化死亡。這與劉國鋒等［12］的研究結果強光會抑制愈傷組織的形成和生長，進而不利于芽的分化是一致的。此外，王磊等［8］也報道經歷黑暗培養，可以促進不定芽的分化。

植物生長調節劑是影響懸鈴木再生效果的關鍵因素之一。周曉玲等［18］研究發現生長素類似物NAA、IAA對二球懸鈴木子葉愈傷組織的分化有促進作用。本研究對三球懸鈴木葉片愈傷組織的不定芽誘導選取KT、IBA、6-BA等3種植物生長調節劑的不同組合進行實驗得出最佳配比，也發現生長素類似物IBA的濃度對三球懸鈴木愈傷組織的不定芽誘導有顯著影響，但隨著IBA濃度的增高，愈傷組織芽誘導率下降，該結果與查向浩等［7］、Liu 等［11］、范國強等［15］的研究結果一致。

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