重組人β淀粉樣蛋白1-42小規模發酵及小量純化工藝的摸索

申茉函，王全才，楊 麗

重組人β淀粉樣蛋白1-42小規模發酵及小量純化工藝的摸索

申茉函1，王全才2，楊 麗3

目的 研究重組人β淀粉樣蛋白1-42(rhAβ1-42)在5 L搖瓶中的高密度發酵實驗，以及小量純化工藝的方法。方法 分別從甲醇濃度、pH、誘導時間等方面對畢赤酵母重組菌株產生rhAβ1-42的發酵過程進行了優化；通過硫酸銨沉淀目的蛋白、透析、脫鹽和陰離子交換層析，對rhAβ1-42小量精確的純化方法進行了研究。結果 確定rhAβ1-42在畢赤酵母中分泌表達的最佳條件為：在pH 6.0的條件下，以0.5%甲醇誘導72 h，經過硫酸銨沉淀目的蛋白、透析、脫鹽和陰離子交換層析，rhAβ1-42純度可達94%以上。結論 確定了rhAβ1-42在畢赤酵母中分泌表達的最佳條件，建立了小量純化rhAβ1-42的新方法。

β淀粉樣蛋白；發酵；小量純化

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)的病理特征以腦神經細胞外出現β-淀粉樣蛋白(Aβ)聚集形成的神經斑或稱老年斑、腦神經細胞內tau蛋白異常聚集形成的神經纖維纏結(NFT)、腦皮層神經細胞減少以及累及皮層動脈和小動脈的血管淀粉樣變性為主[1]。對β淀粉樣蛋白1-42(Aβ1-42)進行細胞學與動物實驗學的研究需要一定的蛋白作為物質基礎。鑒于此，本研究在常規方法的基礎上，進一步探討了甲醇誘導濃度、pH值和誘導時間對畢赤酵母重組工程菌表達rhAβ1-42的影響，對該表達系統進行了小量純化方法的探索，提高了重組工程菌中rhAβ1-42的表達量。通過純化獲得高純度的rhAβ1-42，更好地滿足了研究老年性癡呆疾病細胞學和動物實驗學的需要，從而為臨床治療提供指導。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器 畢赤酵母重組菌株(X33，pPICZα/hAβ1-42)構建并保存;蛋白分子量Marker購自Takara Biotech公司(日本);兔抗人Aβ1-42抗體購自武漢博士德公司;辣根過氧化物酶標記的羊抗兔抗體購自武漢博士德公司;其余試劑均為分析純。畢赤酵母生長培養基包括YPD(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、2%葡萄糖)和BMGY(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽、1.34%YNB、1%甘油)。BMMY(2%胰蛋白胨、1%酵母提取物、100 mmol/L pH 6.0磷酸鹽、1.34%YNB、0.5%甲醇)用于誘導蛋白表達。

1.2 方法

1.2.1 誘導時間對rhAβ1-42表達的影響 將重組菌株接種于生長培養基中，30 ℃培養24 h。離心，收集菌體接入誘導培養基。誘導培養168 h，每24 h取樣一次。分離上清進行SDS-PAGE電泳，并測定菌體濕重。

1.2.2 pH對rhAβ1-42表達的影響 將生長培養基的菌體等量接入pH分別為2.2、2.8、3.4、4.0、4.6、5.2、6.0、7.0的誘導培養基內進行培養。誘導培養72 h后收獲發酵液，離心取上清用于rhAβ1-42的Tricine-SDS-PAGE蛋白分析。

1.2.3 重組畢赤酵母在5 L搖瓶中的高密度發酵實驗 將凍存的工程菌在YPD瓊脂板上(含zeocin 100 μg/mL)30 ℃劃線培養2～3 d。挑取單克隆菌落接種于10 mL YPD液體培養基中，30 ℃搖床振蕩培養24 h。將上述菌液接種于2L YPD液體培養基中，30 ℃搖床振蕩培養24 h，OD600≈10。收集發酵液，等體積BMMY重懸細胞沉淀，甲醇誘導表達，在表達量達到高峰時回收上清用于純化。

1.2.4 rhAβ1-42的小量純化 甲醇誘導培養72 h后，離心獲得發酵液上清，用H2SO4調節其pH值為5.3，取50 mL發酵上清液于4 ℃加入(NH4)2SO4進行分級沉淀，使(NH4)2SO4的飽和度分別為20%、30%、40%、50%、60%、70%，加入(NH4)2SO4時一定要緩慢，并且邊加邊攪拌混勻，至(NH4)2SO4完全溶解后繼續攪拌混勻，4 ℃沉淀2 h左右。取離心后的沉淀，將沉淀用100 μL包被液溶解，進行ELISA分析，結果發現,40%飽和度的(NH4)2SO4沉淀中含有rhAβ1-42。

分析確定rhAβ1-42的(NH4)2SO4沉淀最佳飽和度為40%，將剩余的發酵液上清用H2SO4調節其pH值為5.3，并加入(NH4)2SO4使其飽和度為40%，重復上述40%飽和度(NH4)2SO4的純化步驟，離心收集沉淀并用10 mL PBS緩沖液(pH 7.0)溶解。

2 結果

2.1 誘導時間對rhAβ1-42表達的影響 采用含0.5%甲醇的誘導培養基(pH 6.0)，225 r/min，30 ℃條件下對重組酵母進行誘導表達，不同誘導時間結果見圖1。甲醇誘導24 h，發酵液上清就可檢測到rhAβ1-42，隨著誘導時間增加，重組蛋白的產量具有累積效應，表達72 h達到高峰。

2.2 pH對rhAβ1-42表達的影響 分別測定培養基pH為2.2、2.8、3.4、4.0、4.6、5.2、6.0、7.0時，rhAβ1-42產量的變化。在0.5%的甲醇誘導下，培養基pH為6.0時最有利于rhAβ1-42的分泌表達。見圖2。

圖1 Tricine-SDS-PAGE 篩選Aβ1-42表達的最佳時間圖譜

圖2 Tricine-SDS-PAGE確定畢赤酵母表達Aβ1-42的最佳pH值

2.3 重組畢赤酵母在5 L搖瓶中的高密度發酵實驗 將重組工程菌在上述實驗確定的最佳發酵條件(pH 6.0，甲醇濃度0.5%)下誘導表達，72 h收獲發酵液上清，rhAβ1-42產量可達150 mg/L。

2.4 rhAβ1-42的純化 rhAβ1-42的2 L搖瓶水平表達結束后立即離心分離，取上清經飽和度20%～70%的(NH4)2SO4沉淀，通過ELISA檢測，結果顯示，(NH4)2SO4分級沉淀中40%飽和度的(NH4)2SO4沉淀中rhAβ1-42的含量最高(圖3)。粗品目的蛋白用Phamacia AKTA explorer 100 中壓液相層析系統純化。通過MONO Q陰離子交換層析，獲得rhAβ1-42的單一洗脫峰。

圖3 ELISA檢測確定(NH4)2SO4分級沉淀Aβ1-42最佳濃度

2.5 Western blotting分析純化rhAβ1-42不同純化階段的蛋白經16%Tricine-SDS-PAGE分析，可見純化后的蛋白呈單一條帶，雜蛋白含量較少。rhAβ1-42產量約為350 mg/L，純度可達94%。Western blotting鑒定結果見圖4。

圖4 小量純化Aβ1-42 Western blotting圖

3 討論

AD由德國學者Alosi Alzheimer于1907年首次提出，Aβ蛋白是AD患者腦內神經炎斑的主要成分[2]。1984年，Glenner等[3]和Wong等[4]發現神經炎斑的主要成分是一種由39～43個氨基酸組成，具有β折疊構型的蛋白，稱之為β-淀粉樣蛋白。 Aβ基因疫苗是利用合成Aβ-DNA制成。其作用機制是：該疫苗注入動物細胞后，它所含有的DNA指導細胞合成Aβ，機體免疫反應促使產生針對Aβ的抗體，抗體進入腦內，清除腦內Aβ，起到治療作用。與傳統疫苗相比，基因疫苗生成抗體需更長時間，療效相對緩和，但療效更為持久。Kima等[5]以腺病毒作為載體，攜帶編碼單核細胞集落刺激因子和Aβ的基因疫苗。集落刺激因子具有免疫調制特性，能夠高效擴大機體對抗原的免疫反應[6]。該疫苗經過鼻黏膜給藥免疫AD小鼠，誘導產生以IgG為主的抗體，并且Aβ負荷明顯小于對照組。此外，Zhang等[7]利用重組腺病毒載體(AAV)在體內表達霍亂毒素B亞基(CB)和融合蛋白，霍亂毒素B亞基無毒而且是非Thl淋巴細胞誘導佐荊，能夠產生強有力的體液免疫而不會誘發細胞免疫。試驗結果，AAV-CB-Aβ1-42疫苗1個月后即產生高滴度IgG抗Aβ1-42抗體，2個月后達到最高濃度，持續至少達12個月。疫苗接種2個月后，試驗組抗體滴度是重組腺病毒組Aβ1-42抗體滴度的10倍。

鑒于Aβ1-42蛋白在AD發病中和免疫療法中的重要作用，需要進一步研究Aβ1-42蛋白導致AD的詳細發病機制及其在免疫療法中的作用，要進行上述發病機制的研究和免疫療法的探索，就需要制備大量的Aβ1-42蛋白，但是現有的獲取方式主要是通過人工合成來制備蛋白，成本較高，而且生物學活性低。

畢赤酵母作為一種表達體系具有如下優點：①含有特有的強有力的AOX1啟動子，用甲醇可以嚴格地控制外源基因的表達，當細胞以葡萄糖、甘油、乙醇為碳源生長時，不能檢測到AOX的活性，而在甲醇培養的細胞中，可占細胞總蛋白的30%以上，AOX1啟動子的強誘導性使其下游的外源基因易于調控，并具有很高的表達率；②表達水平高，既可在胞內表達，又可以分泌表達。已報道的畢赤酵母有最高表達量的蛋白為巴西三葉膠腈水解酶，表達量高達22 g/L[8]。絕大多數外源基因比在細菌、釀酒酵母、動物細胞中表達水平高；③發酵工藝成熟，易于放大。已經有大規模工業化高密度生產的發酵工藝，且細胞干重可達130 g/L以上，表達重組蛋白時，已經成功放大到10 000 L；④培養基成分簡單，雜蛋白本底低，產物易于分離純化。已經發現多個高效的畢赤酵母分泌表達信號肽，很多外源蛋白可在畢赤酵母中高效分泌表達，而且畢赤酵母發酵所用的培養基十分簡單廉價，一般為甘油或葡萄糖，其余為無機鹽，培養基中不含蛋白，加之畢赤酵母本身分泌的蛋白水平低，有利于下游產品的分離純化；⑤外源蛋白基因遺傳穩定。一般外源蛋白基因整合到畢赤酵母染色體上，隨染色體的復制而復制，不存在質粒丟失問題；⑤作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酸化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能；⑦無致病性，不產生內毒素等有害物質。因此，畢赤酵母表達體系非常適合于大規模發酵生產重組蛋白[9-10]。

Subrammanian等[11]在大腸桿菌中表達合成編碼的Aβ1-42基因，并進行生產抗原及純化工藝。在合成的基因結構上加了6個寡聚核苷酸，用重疊PCR的方法、采用T7啟動子進行表達重組蛋白。該重組蛋白通過單向Ni2+親和層析純化，用ELISA方法證明重組蛋白具有免疫活性。

胡海濤等[12]研究Aβ蛋白與乙型肝炎核心抗原的融合基因(HBcAg)原核表達，檢測融合蛋白的免疫反應性及免疫原性。將重組質粒pBV220/Aβ-HBcAg轉化大腸桿菌DH5α，調控表達，超聲破碎細菌，通過SDS-PAGE，考馬斯亮藍染色和ELISA等方法，觀察Aβ-HBcAg的表達及融合蛋白的免疫反應性。用該融合蛋白免疫Balb/c小鼠法檢測血清中抗Aβ抗體和抗HBc抗體滴度。結果提示，融合基因Aβ-HBcAg可在大腸桿菌DH5α中表達，表達蛋白有一定的免疫原性和免疫反應性，但表達量低，免疫反應性和免疫原性較弱。

張革等[13]在大腸桿菌中表達Aβ1-42蛋白抗原，表達量達到800 mg/L，菌液純度大于95%。方法是通過化學合成Aβ1-42基因兩個互補片段，通過PCR構建人Aβ1-42基因，將其克隆至pGEX-T表達載體中，并進行原核表達及親和純化GST-Aβ1-42融合蛋白。結果提示，Aβ1-42在體內能夠作為自身抗原，誘導產生Aβ1-42自身抗體。

Youm等[14]利用轉基因植物-馬鈴薯編碼5個串聯重復的Aβ1-42蛋白，利用ER信號肽，轉基因小鼠Tg2576用該馬鈴薯作為藥物飼養，數月后，檢測表明小鼠腦內的Aβ1-42減少。Aβ1-42重復序列蛋白在轉基因馬鈴薯中得到表達并形成有免疫功能的Aβ1-42。因此，可利用這些轉基因馬鈴薯預防及治療AD，其具有一定的研究潛力。

盡管畢赤酵母在表達外源蛋白上存在諸多優勢，但外源基因在表達過程中受自身特性和培養條件的影響而不穩定[15]。本研究以甘油作為畢赤酵母擴增階段的碳源，以甲醇作為誘導表達階段的唯一碳源，YNB作為氮源，在30 ℃下培養重組酵母工程菌。分別研究pH值、甲醇含量、誘導時間對rhAβ1-42產量的影響，確定了重組工程菌分泌表達rhAβ1-42的最佳條件。對rhAβ1-42進行小量純化，因為Aβ1-42的等電點為5.31，所以本實驗首先在Aβ1-42的等電點附近用硫酸銨將目的蛋白沉淀，ELISA分析結果顯示，40%的(NH4)2SO4沉淀中rhAβ1-42的含量最高。用緩沖液溶解沉淀后進行透析脫鹽，脫鹽處理后的溶液用AKTA explorer 100中壓液相層析系統在pH 10.0條件下進行陰離子交換層析純化，收集洗脫峰。Tricine-SDS-PAGE和Western blotting結果顯示，存在相對分子量約為4 000 D的Aβ1-42蛋白，并具有生物學活性。該方法證實重組表達的hAβ1-42與天然hAβ1-42具有相同的免疫原性；該純化方法適合于小規模純化，產量為350 mg/L，純度可達94%。通過純化獲得高純度的rhAβ1-42，更好地滿足了研究老年性癡呆疾病細胞學和動物實驗學的需要。

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Small scale fermentation and a small purification technology of recombinant human β-amyloid peptide 1-42

SHEN Mo-han1，WANG Quan-cai2，YANG Li3

(1.Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China;2.The People′s Hospital of Liaoning Province,Shenyang 110016,China;3.Key Laboratory of Zoonosis Research of Ministry of Education,Jilin University,Changchun 130021,China)

Objective To study the high-cell-density fermentation experiment of human recombinant β-amyloid protein 1-42(rhAβ1-42) in 5 L shake flask and the method of small scale purification.Methods Fermentation parameters of rhAβ1-42was further optimized mainly on concentration of methanol induction,pH value,and induced time.Secreted supernatant of rhAβ1-42was purified with ammonium sulphate sediment,dialysis desalination and anion-exchange chromatography.Results The optimal condition of rhAβ1-42expressed in Pichia pastoris was: under the condition of pH=6,induced by 0.5% methanol for 72 h,precipitation of target protein by ammonium sulfate,dialysis desalting,anion exchange chromatography,rhAβ1-42purity could reach more than 94%.Conclusion A stable fermentation and new technology of the small scale purification is successfully set up.

β-amyloid protein;Fermentation;Small scale purification

2014-09-16

1.中國醫科大學附屬盛京醫院，沈陽 110004；2.遼寧省人民醫院，沈陽 110016；3.吉林大學人獸共患研究教育部重點實驗室，長春 130021

國家高技術研究發展計劃(863計劃)(2004AA205020)

10.14053/j.cnki.ppcr.201503003