競爭性ELISA法測定軟骨細胞蛋白聚糖代謝片段的可行性分析

周惠瓊 張 清 葉 彬 孫曉萱 楊文芳

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競爭性ELISA法測定軟骨細胞蛋白聚糖代謝片段的可行性分析

周惠瓊 張 清 葉 彬 孫曉萱 楊文芳

目的 本研究探討競爭性ELISA法測定軟骨細胞蛋白聚糖代謝片段的可行性，為蛋白聚糖相關研究提供一個新的方法。方法 利用單克隆抗體(Mab-5D4)通過競爭性ELISA 法檢測體外培養的兔關節軟骨細胞蛋白聚糖的代謝片段，摸索最佳實驗條件，計算本方法的板間差異和板內差異，同時通過DMMB分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物糖胺聚糖(GAG)，并比較它們的相關性。結果 競爭性ELISA法測定蛋白聚糖5D4片段方法的板間差異為10.38%，板內差異為3.91%，實驗組培養上清液5D4片段的濃度明顯高于對照組(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。與常規分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物GAG有較好的相關性(r=0.453～0.579，P=0.001)。結論 競爭性ELISA法測定蛋白聚糖代謝產物方法簡便，重復性好，可應用于蛋白聚糖代謝的相關研究。

蛋白聚糖 ELISA 軟骨細胞

軟骨是關節的主要結構之一，蛋白聚糖(aggrecan)與Ⅱ型膠原同為關節軟骨的主要成分，其中蛋白聚糖異常代謝是軟骨病變的主要表現，常見的關節炎如骨關節炎(osteoarthritis,OA)及類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)都存在蛋白聚糖的異常代謝。既往蛋白聚糖的代謝研究常采用DMMB分光光度法測定蛋白聚糖的代謝物糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)來代表蛋白聚糖的降解，影響因素多，結果不穩定。近年來發現用針對蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體(Mab)通過ELISA法來檢測蛋白聚糖的不同代謝片段，方法簡單，重復性好，有一定的應用價值[1,2]。其中Mab-5D4 為一種識別蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體，它可與蛋白聚糖核心蛋白區的硫酸角質素(keratinsulphate，KS)鏈中重復出現的硫化七糖結合，所檢測產物5D4片段是蛋白聚糖降解的標志物[3]。本實驗利用Mab-5D4通過競爭性ELISA 法檢測體外培養的軟骨細胞蛋白聚糖的代謝片段，以其摸索出一種簡便而又實用的檢測蛋白聚糖代謝片段的方法，應用于蛋白聚糖相關的科研和臨床研究。

材料與方法

1.主要試劑：牛軟骨提取的蛋白聚糖(Sigma公司),Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，二甲基亞甲藍(1,9-dimethylmethylene blue，DMMB，Serva公司)，硫酸軟骨素A(Seikagaku Kogyo公司)，細胞培養液達氏修正依氏培養基(DMEM)/F12(Invitrogen公司)，軟骨細胞源自新西蘭大白兔(西澳大學動物中心提供)，Mab-5D4(Mdbioproducts公司)。本研究通過中日友好醫院倫理委員會批準。

2.軟骨細胞培養：軟骨細胞取自新西蘭大白兔膝關節的股骨髁。軟骨細胞原代培養方法參照文獻[4]。細胞單層融合后按1∶2傳代，第1代軟骨細胞采用噻唑藍(MTT)法檢測細胞存活率，選擇細胞存活率均>95%的適當實驗濃度做進一步的實驗。將第1代軟骨細胞轉入12孔的組織細胞培養板，每孔細胞數為1.5×105/L，培養48 h后，為去除小牛血清對GAG和蛋白聚糖分解片段測定的干擾，用不含小牛血清的培養液洗滌2次。此后的培養均采用無小牛血清的培養液。將軟骨細胞隨機分為對照組、TNF-α組，每組設3孔，TNF-α組為培養液中含10 ng/ml的TNF-α,對照組為培養液中無任何刺激因子。所有細胞繼續培養8天，每2天更換收集培養液并儲存于-20℃冰箱待進一步實驗用。

3.競爭性ELISA法檢測蛋白聚糖的代謝片段[5]：為了去除邊沿效應，每次實驗只利用標準酶標板居中的60孔，舍棄周邊孔。標準參照物為軟骨素酶處理后的蛋白多糖(protroglycan treatment with chondroitinase,PG CASE)。(1)確定Mab-5D4在ELISA中的最佳作用濃度: 將購置的原液Mab-5D4按1/500、1/5000、1/10000、1/20000、1/40000及1/80000稀釋，以吸光度約為1，斜率最大處的Mab-5D4稀釋度為最佳工作濃度。(2)建立標準曲線：每一酶標板均建立標準曲線，標準曲線的稀釋濃度為：PG CASE: 1000、500、250、125、62.5、31.25、15.6、7.8、3.9ng/ml。復孔檢測，并設空白對照及非特異結合孔。(3)檢測本實驗中ELISA方法的穩定性：通過測定本實驗方法的酶標板板間差異(inter-run variability)和板內差異(intra-run variability)，用以下的公式計算板間和板內的變異系數(coefficient of variance, CV)，了解本實驗方法的穩定性。CV=標準差/均數(A值)×100%。板內的變異系數：同一份待測的培養液，在同一酶標板同時測定6次，復孔測定，共12孔。取A值計算CV。板間的變異系數：同一份待測培養液在不同的酶標板中重復測定6次，復孔檢測，取A值計算CV。

4.測定細胞培養液中蛋白聚糖5D4代謝片段: 用125ng/ml的PG CASE包被酶聯反應板,100微升/孔, 4℃濕盒過夜。棄包被液,200μl封閉液37℃封閉1h,洗滌液洗滌3次。用稀釋液配制10個1∶2連續稀釋的標準抗原(PG CASE)溶液；取150μl的Mab-5D4(1∶200000稀釋),加到圓底的微量滴定板的每個孔中,再加入150μl不同稀釋倍數的標準抗原。 同時以相同方法混合Mab-5D4和待測培養液(均適當比例稀釋),混勻溶液,37℃放置60min。將100μl的標準混合液及待測混合液轉移到抗原包被板中,37℃作用1h，洗滌3次。加入酶標Ⅱ抗(羊抗鼠IgG)到各反應孔中,100微升/孔,37℃作用60min，洗滌3次。將底物加入到各反應孔中,100微升/孔, 37℃作用90min。加入50微升/孔的終止液。

5.軟骨細胞及培養液中GAG的測定：GAG的含量采用DMMB分光光度法測定，體外軟骨細胞培養過程中，GAG釋放入培養液中的水平代表蛋白聚糖的降解程度，釋放入培養液中的GAG越多．表明蛋白聚糖的降解越明顯。本實驗采用GAG釋放至培養液中的量占總體GAG(細胞內+培養液)的百分率表示蛋白聚糖的降解。

結 果

根據不同Mab-5D4抗體濃度的實驗結果，1/200000Mab-5D4稀釋度為本研究ELISA法最佳工作濃度。應用競爭性ELISA法檢測蛋白聚糖代謝片段5D4的結果穩定性，板內差異見表1，板間差異CV的結果見表2。

表1 同一份待測培養液在同一酶標板重復測定6次(共12孔)的A值

表2 同一份待測培養液在不同酶標板重復測定6次(共12孔)的A值

圖1 ELISA法測定培養液中5D4片段含量的標準曲線

ELISA法測定培養液中5D4片段含量的標準曲線(以其中一酶標板為例，圖1)。培養8天時培養液中5D4片段總含量測定，試驗組培養液中5D4片段的含量與對照組比較明顯增多(328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001)。培養不同時間(2～8天)時，培養液中兩組細胞5D4片段釋放均逐漸減少，培養的前3個時間段(2、4和6天)， TNF-α組釋放的5D4片段均比對照組明顯增多(P=0.000)。而培養的最后兩天，兩組細胞釋放的5D4片段無區別。

表3 軟骨細胞培養不同時間段培養液中5D4含量及GAG釋放的百分率

#組別1、2、3、4分別代表培養的時間段：2、4、6及8天。與對照組比較，*P=0.000

軟骨細胞培養不同時間段(2～8天)時GAG釋放入培養液的百分率在培養的第1時段(2天)，TNF-α組軟骨細胞GAG釋放高于對照組(61.47%±12.90% vs 34.54%±6.43%,P=0.000),其余3個時間段兩組無差別,詳見表3。軟骨細胞培養的不同時間段GAG的釋放與5D4片段檢測的結果呈明顯正相關(r=0.453～0.579，P=0.000)。

討 論

軟骨是關節的重要組成部分，軟骨細胞的主要功能是分泌細胞外基質，維持軟骨的正常代謝從而維持關節的完整性和穩定性。蛋白聚糖是軟骨細胞的產物之一，與Ⅱ型膠原同為關節軟骨的主要構成成分。20世紀60年代，國外研究者就對蛋白聚糖異常代謝與關節疾病間的關系做了相關研究，認為蛋白聚糖的進行性破壞與關節病變有明顯的相關性，OA患者血清及關節液的蛋白聚糖代謝片段水平與關節的放射學改變有關，蛋白聚糖的異常代謝可望能預測關節破壞的進程[6～8]。

蛋白聚糖的主體結構由一個核心蛋白和3個球狀結構域(globular domain, G1, G2, G3)組成。核心蛋白在G2和G3之間，是富含GAG側鏈的區域，GAG的主要成分是硫酸角質素(KS)和硫酸軟骨素(chondroitin, CS)，核心蛋白的GAG區域是易受蛋白酶作用的部位，測定GAG的分泌常作為蛋白聚糖代謝的指標。近年來，針對蛋白聚糖不同部位的Mab逐漸用于研究與關節相關的蛋白聚糖代謝[9,10]。Straglics等[11]用多種針對蛋白聚糖不同部位的Mab檢測幼年特發性關節炎患者的關節液，發現他們的蛋白聚糖代謝模式不同于成年OA患者。

Mab-5D4 為一種識別蛋白聚糖代謝片段的單克隆抗體，它可與蛋白聚糖核心蛋白區的KS鏈中重復出現的硫化七糖結合，所檢測產物5D4片段是蛋白聚糖降解的標志物[3]。既往研究發現體外培養的豬軟骨小體在機械性壓力作用下，5D4片段不同程度地增多，其增多的程度和蛋白聚糖代謝的標志物GAG的變化相平行。在十字韌帶切斷的損傷性膝關節炎模型中，損傷后的第1周90%的關節積液中5D4片段明顯增多，在2～3周所有損傷關節的積液均可檢測到5D4 片段，而對側正常關節的積液中始終無5D4片段出現，提示急性損傷可引起蛋白聚糖的降解。

國內有關蛋白聚糖相關研究較少，特別是應用單克隆抗體通過ELISA法檢測蛋白聚糖代謝片段的可行性如何一直無相關報道。本研究選擇可與蛋白聚糖核心蛋白區的KS鏈結合的Mab-5D4，通過競爭性ELISA法檢測體外培養的兔膝關節軟骨細胞蛋白聚糖代謝片段，計算不同酶標板的板間和板內的變異系數，了解本方法的板間差異和板內差異，判斷其結果穩定性。為了更好地區分蛋白聚糖在異常條件作用下的代謝情況,本研究選擇了常見的炎性因子TNF-α作為刺激因子,觀察軟骨細胞受刺激后蛋白聚糖的代謝情況與正常對照組的比較。

本研究結果顯示，用Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段的板內CV值為3.91%，板間CV值為10.38%，與既往的研究相似，均具有較好的穩定性，為可以推廣應用的范圍[5]。實驗中TNF-α組的總體5D4片段含量明顯高于對照組，說明TNF-α可刺激軟骨細胞蛋白聚糖的分解。本實驗同時顯示用Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段與GAG測定值有較好的相關性(r=0.453～0.579，P=0.001)。

在不同時間段的實驗中，前3個時間段(2、4、6天)TNF-α組的5D4片段均明顯大于對照組，第4時間段兩組間無差別，而GAG的結果有所不同，雖然TNF-α組4個時間段的GAG結果均大于對照組，但只有第1時間段(2天)差異有統計學意義，其他3個時間段僅略高于對照組。說明本實驗所測的兩個指標雖然都代表蛋白聚糖的降解，有一定的相關性，但它們之間還是有所差別，可能代表蛋白聚糖核心蛋白區不同部位的降解。

本研究顯示，競爭性ELISA法通過Mab-5D4測定蛋白聚糖代謝片段的方法穩定性好，重復性高，與傳統的蛋白聚糖代謝指標GAG有較好的相關性，如同時應用兩種方法可望能更好地進行蛋白聚糖代謝的相關研究。

1 周惠瓊，張奉春.抗蛋白聚糖單克隆抗體在關節軟骨代謝研究中的應用[J].中華風濕病學雜志,2007，11(8):503-505

2 Hughes CE, Caterson B, Fosang AJ,etal.Monoclonal antibodies that specifically recognize neoepitope sequences generated by aggrecanase and matrix metalloproteinase cleavage of aggrecan: application to catabolism in situ and in vitro[J]. Biochem J,1995,305(3):799-804

3 Hayes AJ, Hughes CE, Caterson B. Antibodies and immunohistochemistry in extracellular matrix research[J].Methods, 2008,45(1):10-21

4 Guerne PA, Sublet A, Lotz M.Growth factor responsiveness of human articular chondrocytes: distinct profiles in primary chondrocytes, subcultured chondrocytes, and fibroblasts[J].J Cell Physiol, 1994,158(3):476-484

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6 Struglics A, Hansson M, Lohmander LS. Human aggrecanasegenerated synovial fluid fragment levels are elevated directly after knee injuries due to proteolysis both in the inter globular and chondroitin sulfate domains[J]. Osteoarthritis Cartilage, 2011, 19(8):1047-1057

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10 Lotz M,Martel-Pelletier J,Christiansen C,etal. Value of biomarkers in osteoarthritis: current statusand perspectives[J]. Ann Rheum Dis,2013,72:1756-1763

11 Struglics A,Lohmander LS,Last K,etal. Aggrecanase cleavage in juvenile idiopathic arthritis patientsIs minimally detected in the aggrecanInterglobular domainbut robust at the aggrecan C-terminus[J]. Arthritis & Rheumatism, 2012,64(12):4151-4161

(修回日期：2015-02-26)

Feasibility of ELISA for the Measurement of 5D4 Fragments in Culturedarticular Chondrocytes.

ZhouHuiqiong,ZhangQing,YeBin,etal.

DepartmentofRheumatology,TheFirstAffiliatedHospitalofGeneralHospitalofPLA,Beijing100048,China

Objective Monoclonal antibodies (Mab) of 5D4 which specifically against structural carbohydrate epitopes on the KS of aggrecan have been produced and used to detect the fragment of aggrecan which represents the abnormal metabolism of articular cartilage.Methods Articular chondrocytes were cultured with stimulated subject of TNF-α for up to 8 days.Aggrecan catabolic fragments in medium were measured by ELISA using Mab-5D4. The inter-run variability and intra-run variability were calculated. The GAG was measured by using a modification of a 1,9-dimethylmethylene blue spectrophotometric assay (DMMB) and the correlations with the results of ELISA were detected.Results The coefficient of variance of inter-run and intra-run of ELISA were10.38% and 3.91%, respectively. Fragments of 5D4 in medium of TNF-αgroups significantly increase than control (328.22ng/ml vs 184.61ng/ml,t=5.67，P=0.001).There were good correlations between the results of ELISA and GAG detected by DMMB assay(r=0.453-0.579，P=0.001). Conclusion The consistency and repeatability of ELISA to detect the fragments of 5D4 released by chondrocytes is acceptable. The method can be used in the study of metabolism of aggrecan.

Chondrocyte;ELISA;Aggrecan

首都臨床特色應用研究基金資助項目(Z121107001012019)

100048 北京，解放軍總醫院附屬第一醫院風濕科(周惠瓊、張清)；100029 北京，中日友好醫院風濕免疫科(周惠瓊、葉彬、孫曉萱、楊文芳)

周惠瓊，教授，主任醫師，電子信箱：13901188181@163.com

R3

A DOI 10.11969/j.issn.1673-548X.2015.10.015

2015-01-27)