10個半滑舌鰨家系MHC IIB基因多態性初步研究

牛寶珍,杜 民,陳松林

(1.紅河學院 云南省高校農作物優質高效栽培與安全控制重點實驗室,云南 蒙自 661199;2.中國水產科學研究院黃海水產研究所 農業部海洋漁業可持續發展重點開放實驗室,山東 青島 266071)

主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)是目前已經研究的脊椎動物基因組最具多態性區域,它的編碼產物在獲得性免疫中起著很大的作用[1-2],這些編碼產物結合抗原肽以及與T細胞受體(TCR)相互作用從而激發一個特定的免疫反應[3-4]。已經報道了魚類中 MHCⅠ類和Ⅱ類分子,它們結合不同的T細胞而分為兩類MHC基因編碼蛋白[5]。魚類上 MHC基因的研究開始于 Hashimoto等[6]1990年對鯉魚(Cyprinus carpio)的研究。目前,許多魚類MHC基因已經被分離出來,包括鯊魚(Carcharodon carcharias)[7-8]、麗魚(Alticorpus macrocleithrum)[9]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[10]、大黃魚(Pseudosciaena crocea)[11]、鯉魚[12]等。

半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)屬鰈形目(Pleuronectiformes)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(Cynoglossus),俗稱牛舌、鰨目、鰨米等,分布于中國黃渤海,在東海、南海、也有分布[13]。在鰨類中半滑舌鰨為個體偏大種類,因其味道優美,營養豐富受消費者喜愛,已經成為中國新開發的養殖品種[14];半滑舌鰨的MHCⅠ類基因[15]、β2m基因[16]、Ⅱ類A和Ⅱ類 B[17]已經被確定出來。每個 MHCⅡ類 B基因編碼區多態性最高片段是其第二外顯子編碼的β1結構域[18];β1結構域和MHCⅡ類A基因編碼的α1結構域一起組成了MHCⅡ類分子的多肽結合槽,從而能夠錨定外源多肽[19]。MHC基因的高度變異使得在一個群體中產生了大量等位基因,每個等位基因或多或少的具有結合和呈遞不同類型多肽的能力[5]。因此,一個有機體對特定抗原的反應可能受到 MHC基因單倍型的影響。魚類中,大西洋鮭(Salmo salar)MHCⅡ類基因多態性已經被研究[20-21],Du等[22]對牙鲆(Paralichthys olivaceus)7個家系中的 MHCⅡ類基因多態性進行研究并且對大菱鲆的MHC的抗遲鈍愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)與MHCⅡ類基因的特定基因型的關聯性進行了相關研 究[23]。

本實驗室于2008年采用雄性野生群體與雌性養殖群體生產出18個半滑舌鰨家系[24]。本研究目的是檢測10個半滑舌鰨家系MHCⅡB(Cyse-DAB)基因的多態性水平、MHCⅡ類B位點數目以及平衡選擇的作用,為半滑舌鰨的分子標記輔助育種提供基礎性資料。

1 材料和方法

1.1 實驗魚

2008年 9月,在山東省萊州明波水產養殖公司建立半滑舌鰨全同胞家系和半同胞家系,親本來源、家系建立飼養情況參照陳松林等[24]的報道。

1.2 取樣及DNA提取

從10個普通半滑舌鰨家系中各隨機選取5尾魚,每尾體質量7～8 g,利用MS222(1g/kg)麻醉后剪取尾鰭保存在無水乙醇中。利用酚-氯仿方法[25],從尾鰭中提取半滑舌鰨總的 DNA。用 1%的瓊脂糖凝膠進行電泳,在凝膠成像儀上進行 DNA濃度檢測,并將其濃度均調至為100 ng/μL,–20℃保存。

1.3 引物設計和多聚酶鏈式反應(PCR)

根據 Xu等[15]報道的 cDNA序列設計的特定引物: hMPN12 (5′-CTCTCTTCTCTTCCTCCTCAC-3′)和 hMPC-12 (5′-ACACTCACCTGATTTAGCCA-3′),擴增半滑舌鰨 MHCⅡB第二外顯子序列,上游引物和下游引物分別位于第一外顯子和第二外顯子的末端。

25 μL的PCR反應混合物包含1 μL的半滑舌鰨基因組DNA模板、2.5 μL的10×TaqDNA多聚酶緩沖液(TransGen Biotech)、1.5 mmol/L MgCl2、0.2 mmol/L dNTPs、0.2 μmol/L的特定引物(正向引物和反向引物)、1 UTaq多聚酶。PCR反應程序為94℃預變性5 min、然后30個循環(94℃變性40 s、53℃退火40 s、72℃延伸50 s),最后72℃延伸10 min。PCR反應在Peltier 熱循環儀(PTC-200)上完成。利用凝膠成像系統(Molecular Imager Gel Doc XR Biorad美國)檢測確認擴增片段。

1.4 克隆和DNA序列測定

切割預期大小PCR產物的膠并且利用QIAEXII凝膠回收試劑盒(QIAGEN)進行回收純化。根據操作說明書將純化產物連接到 PBS-T載體后,轉化到TOP10大腸桿菌感受態細胞。利用M13的正向和反向引物進行 PCR篩選陽性克隆;每個體的擴增產物選5個克隆在ABI3730自動測序儀上用M13+/–引物測序。

1.5 基因型、序列分析和統計檢驗分析

利用 DNAMAN軟件對所有的序列數據進行比對分析。同義替換(dS)與非同義替換(dN)的比率用MEGA4.0軟件[26]中修正 Nei和 Gojobori的成對-距離方法[27]進行估算。用 DAMBE軟件和 DnaSP5.0軟件用來分析序列核苷酸值[28]。用SPSS13.0軟件來進行統計分析。根據Davies等[29]報道的規則命名新發現的等位基因[30-31]。

2 結果與分析

2.1 10個半滑舌鰨家系中MHC II第二外顯子序列的多態性

本研究中從10個家系共選取50個體,每個體選取5個克隆進行克隆及測序,得到250個序列。根據已發表的半滑舌鰨MHCⅡB cDNA序列[17]和內含子-外顯子的GT-AG剪接規則,共得到397 bp片段,包含35 bp的第一外顯子、整個第一內含子(84 bp,包含一個12bp的CA重復序列)以及完整的第二外顯子序列(270 bp)。第二外顯子編碼MHCⅡB基因的β1結構域。有些序列僅發現一次,推測可能是由于 PCR錯誤所致,如錯配、Taq DNA 聚合酶錯誤等。另外大腸桿菌異源雙鏈修復錯誤也是可能原因[32-33]。刪除這些序列后得到60個不同的序列,有32個序列與本實驗室已獲得序列相同[34],本研究中新發現28個,代表 28個不同的等位基因,并遞交到 GeneBank上(表 1)。

10個家系中每個體選取 5個克隆進行測序,只發現1個等位基因的有2個個體,發現2個等位基因的有6個體,發現3個等位基因的有21個體,發現4個等位基因的有15個體,發現5個等位基因的有6個體。表 2 顯示每個體等位基因數目及對應個體的數目,在10個半滑舌鰨家系中MHCⅡB基因上,只有 4% 的檢測個體是純合體(所有的家系都是雜合的),亦即在4#和19#家系中各出現一個純合體(所測的序列完全相同)。各個家系等位基因的頻率在每個家系中的分布不具有顯著性。1#、3#、4#、6#、16#、19#、24#、28#、33#、34#家系中出現的序列和全部序列相似性分別為 89.89%、94.26%、88.24%、92.35%、94.67%、93.7%、90.37%、90.16%、93.22%、88.84%和89.36%。

在得到的 60個 MHCⅡB基因第二外顯子序列中沒有發現插入、缺失和終止密碼子,表明這些序列來自于半滑舌鰨基因組的功能位點。在60個序列中,每個位點核苷酸多態性值Pi (p)和Theta-W值分別是0.14008和0.08975;270個核苷酸位點中有113個變異位點: 其中91個是簡約信息位點。單倍型多樣性值(H)和核苷酸差異平均數目(k)分別為1和37.823。

表1 等位基因和Genbank登錄號Tab.1 Alleles and their GenBank accession number

表2 10個半滑舌鰨家系中每尾魚的Scma-DAB等位基因數目和5種等位基因情況下的個體數目Tab.2 The allele number per individual in 10 half-smooth tongue sole families and the individual number in five different allele models

2.2 半滑舌鰨MHCⅡB 基因選擇作用

在半滑舌鰨MHCⅡB基因第二外顯子多肽結合區(PBR),23個氨基酸位點中有20(86.96%)個是變異位點,并且在69個核苷酸中有40(57.97%)個是變異位點。在60個序列的多肽結合區中,非同義替換(dN)和同義替換(dS)的值分別是0.285和0.127,非同義替換(dN)與同義替換(dS)的比值為 2.2441;而在非多肽結合區中,非同義替換(dN)和同義替換(dS)的值分別為 0.095和 0.130,表明在多肽結合區經歷著正向的達爾文選擇(表3)。表3列出了每個家系代表序列在多肽結合區的非同義替換和同義替換的比值,只有28#家系個體中的多肽結合區的非同義替換與同義替換的比率不具有顯著性外,另外的 9個家系中的多肽結合區的非同義替換顯著高于同義替換,表明在這些家系中個體MHCⅡB基因多肽結合區的堿基經歷達爾文選擇。半滑舌鰨多肽結合區推斷和鑒定是根據Brown等[19]對人類HLA-DRB 基因相應區域的限定。

3 討論

MHCⅡB 基因最多態性的區域是由β鏈第二外顯子非同義替換造成的。在本研究中,作者利用PCR和直接測序方法揭示了 10個半滑舌鰨家系中 MHC classⅡB 基因第二外顯子基因多態性和選擇作用;也有其他魚類的相關報道: Xu 等[35]在 12個牙鲆家系60個體中發現76個等位基因;Rakus等[36]在9個鯉魚品系中發現 7個不同的 MHC classⅡB 基因單倍型并且這些單倍型的頻率也不相同;Stet等[37]在84個大西洋鮭個體上發現 7個 Sasa-DAA和 7個Sasa-DAB等位基因;Langefors等[38]通過直接測序在25個波羅的海大西洋鮭的22個限制性片段長度多態單倍型中確認17個MHC classⅡB基因第二外顯子等位基因。作者對50個半滑舌鰨家系個體中發現60個MHCⅡB等位基因表明半滑舌鰨遺傳多樣性較高。

表3 10個半滑舌鰨家系中MHCⅡB 基因第二外顯子中多肽結合區(PBR)、非多肽結合區(non-PBR)的同義替代率(dS)和非同義替代率的比值及顯著性分析Tab.3 Synonymous(dS)and non-synonymous(dN)substitution rates and significant levels in the putative peptides binding region(PBR)and non-peptides binding region(non-PBR)among half-smooth tongue sole alleles

本研究半滑舌鰨個體中,有6個個體出現5個不同等位基因,從而推測半滑舌鰨的 MHCⅡB基因至少存在3個位點或者拷貝,這與Xu等[17]的研究結果相一致。相似的報道也在其他魚類中發現: 李華等[39]利用PCR-SSCP和直接測序的方法對豬SLA-DQB基因第二外顯子進行分析后發現有的個體中存在 5個不同等位基因現象,從而推斷在有些品種豬中具有3個DQA基因拷貝或位點;張玉喜等[40]通過直接測序發現84個牙鲆個體中有59個體表現2種或2種以上不同序列,并且其中有一個個體中發現有 5種不同的序列,推測這些個體具有較高的雜合度或者至少存在3個不同的基因位點。本文每個體僅測了5個克隆,是否增加克隆數就可以有發現更多的等位基因呢？這在以后的類似的工作中要作進一步驗證。

關于MHCⅡB基因第二外顯子多態性的假說有:雜種優勢、超顯性選擇、頻率依賴的選擇或平衡選擇[41]。目前許多相關研究支持平衡選擇假說[42-43],平衡選擇經常通過在多肽結合區的非同義替換率(dN)與同義替換(dS)的比率來進行推斷。如果dN/dS的比率顯著高于1,則表明正向選擇在起作用。在本研究的10個半滑舌鰨家系MHCⅡB序列中,除28#家系中的 MHCⅡB基因序列多肽結合區(PBR)的非同義替換比率與同義替換比率不具有顯著性外(Z檢驗的P=0.054＞0.05),另外9個家系中MHCⅡB基因序列在多肽結合區(PBR)的非同義替換要顯著高于同義替換(表3)。據此認為在半滑舌鰨MHCⅡB基因進化過程中受到正向選擇的影響,從而產生如此多的等位基因。作者發現在半滑舌鰨MHCⅡB基因的多肽結合區上非同義替換高于同義替換,推測半滑舌鰨MHCⅡB基因可能與人類 HLA-DRB基因具有相似的功能[19]。各等位基因在個體及家系中出現的頻率也不同,可能是由于個體對環境的選擇壓力不同而造成的[43]。本研究發現的 60個等位基因中,有 32個等位基因所在實驗室已有報道[34],另外28個等位基因為新發現,表明等位基因也具有個體或者群體差異。

總之,在10個家系50個體中發現了60個序列,表明在半滑舌鰨的MHCⅡB基因第二外顯子具有高度多態性,為下一步在半滑舌鰨家系間 MHCⅡB等位基因與抗/易感特定病原間的相關性研究提供基礎資料。

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