NaCl脅迫對荊芥種子萌發及幼苗抗氧化酶活性的影響

張瑞娥，王 娟， 王智穎， 豆麗君， 劉小麗，2*

(1.阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，安徽 阜陽 236037)

NaCl脅迫對荊芥種子萌發及幼苗抗氧化酶活性的影響

張瑞娥1，王 娟1， 王智穎1， 豆麗君1， 劉小麗1，2*

(1.阜陽師范學院 生物與食品工程學院，安徽 阜陽 236037；2.抗衰老中草藥安徽省工程技術研究中心，安徽 阜陽 236037)

用紙床培養，通過測定萌發率、胚根長、胚芽長、鮮重等生物量指標及各項生理生化指標的方法探究了不同濃度NaCl(0 mmol/L、25 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L)脅迫對特大葉荊芥幼苗種子萌發及幼苗生長的影響。結果表明：NaCl脅迫對荊芥種子萌發率無明顯影響，而荊芥根長、芽長、鮮重、子葉展開數和種皮脫落數等均隨濃度的增加呈下降趨勢，當脅迫濃度≥100 mmol/L時抑制極為顯著。SOD和POD活性在25 mmol/L的NaCl脅迫濃度下較對照組升高，而在其后的脅迫濃度下均較對照組低，陰離子氧生成量表現出相應的先下降后上升的趨勢。

荊芥；NaCl脅迫；種子萌發；生理指標；抗氧化酶

長期以來, 自然因素和人為因素的影響導致土地鹽漬化情況越來越嚴重[1]。鹽堿土環境下，由于離子間的相互拮抗、離子的非滯留性和強淋溶性等原因，而致使土壤中一些植物生長所必需元素含量降低或有害物質含量增加[2]，進而改變植物細胞的結構[3]及植物的基礎代謝[4-6]，在種子萌發[7]、苗期生長[8]直至整個生命周期中對植物造成很大的傷害。因此，目前不僅要關注于鹽堿土壤的改良，亦要了解植物鹽脅迫的生理機制，以為鹽堿狀態下植物的栽培奠定理論基礎。

荊芥(NepetacatariaL.) 為唇形科的一年生草本植物，其干燥地上部分，是臨床常用中藥[9-10]。荊芥中葉大者更為鮮嫩，稱為“大葉荊芥”，而特大葉荊芥(葉長6～8 cm，寬3～5 cm)的產量較大葉荊芥的產量要高出35%～85%[11]。通過研究不同濃度梯度的NaCl 脅迫對荊芥種子萌發、幼苗性狀和生理指標的影響，可為篩選、鑒定和培育耐鹽堿荊芥提供重要指導意義。植物整個生命周期的關鍵是種子萌發和幼苗生長，李秀霞、張吉立、 張錦偉、于泉林等人及國家標準中都采用種子萌發和幼苗生長狀況作為評價鹽害對植物的影響程度的指標[12-16]。前人通過鹽脅迫對紫蘇、海濱錦葵、決明等類似荊芥的藥用植物的種子萌發和幼苗生長等方面進行了研究[17-19]。但是針對特大葉荊芥種子，NaCl脅迫對其的影響的研究還鮮見報道?；诖?，本試驗主要以特大葉荊芥種子為試驗材料，對其進行一定時間的NaCl脅迫處理和緩解生長，探究NaCl脅迫對特大葉荊芥種子萌發、幼苗生長及生理生化指標的影響，以期為解決鹽脅迫對荊芥的危害及荊芥耐鹽性鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料

供試品種為特大葉荊芥種子，購于阜陽市潁匯大市場。

1.1.2 試劑配制

蒸餾水；NaCl母液；Hangland完全培養液；0.05 mol/L磷酸緩沖液(PH7.8)；SOD反應液[130 mmol/L甲硫氨酸溶液、750 μmol/L氮藍四唑溶液、100 μmol/LEDTA-Na2溶液]；20 μmol/L核黃素溶液；20 mmol/L KH2PO4；POD反應混合液[取100 mmol/L PH6.0 PBS 50 mL，加入愈創木酚28 μL，加熱攪拌，直至愈創木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30% H2O219 μL,混合均勻，保存于冰箱中]；1 mmol/L鹽酸羥胺(70 mg/L)；磺胺；萘胺。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子處理

荊芥種子用0.1% KMnO4浸泡消毒15分鐘，用蒸餾水沖洗干凈，并將漂浮于水面上的死種子挑出，重復至溶液無色。

1.2.2 種子萌發試驗

準備18套干燥而潔凈的直徑為9 cm的培養皿，平均分成三組即3個重復，對每組培養皿對應NaCl濃度(0、25、50、100、150、200 mmol/L)進行編號(NCK、NT1、NT2、NT3、NT4、NT5)并貼標簽，每培養皿墊2張定性濾紙后加入對應濃度的NaCl溶液20 mL，從消毒過的荊芥種子中精選大小一致、健壯飽滿的籽粒，分別取100 粒種子擺放入墊有2 層濾紙的培養皿中，盡量保持籽粒間間距一致，避免垛疊影響結果，擺放完成后，將培養皿置于恒溫培養箱中，25 ℃無光照培養。每天需定時定量更換濾紙及處理液(前5天為20 mL，后幾天為10 mL)，觀察種子萌發情況并記錄發芽粒數。

1.2.3 緩解生長試驗

待NaCl各濃度中均再無種子萌發后，更換濾紙，并將處理液更換為Hoagland 營養液每皿5 mL，將材料移入智能光照培養箱中培養，白天12 h、25 ℃、六級光照；晚上12 h、23 ℃、無光照，每天根據干濕度情況對材料適量添加Hoagland完全培養液，使植物體正常生長，并于兩周后觀察記錄荊芥成苗數。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生物量指標的測定

NaCl脅迫處理前8天每天觀察并記錄每培養皿中的種子萌發數，計算萌發率；于第9天觀察記錄子葉展開數和種皮脫落數；第10天，每皿隨機選取10株荊芥植株，測其根長、芽長，用濾紙吸干植株表面水分后測量鮮重；計算緩解生長后的成苗率。

1.3.2 抗氧化酶活性的測定

1.3.2.1 酶液的提取

每一處理組中分別稱量完整的荊芥植株0.3 g放入預冷的研缽中，加1 mL預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(PH7.8)研磨，待研磨成勻漿后再加1 mL磷酸緩沖液(PH7.8)繼續研磨，之后將其轉移到10 mL離心管中，先后加2 mL磷酸緩沖液到研缽中洗滌兩次，再轉移到離心管。將離心管放入離心機中，所得勻漿用LD-4A低速離心機于4 000 r/min下離心10 min,將上清液小心倒入干凈的離心管，即為提取的酶液。

1.3.2.2 酶活性及陰離子氧生成量的測定

SOD( 超氧化物歧化酶) 活性的測定采用王學奎的NBT(氮藍四唑)法[20]；POD (過氧化物酶)活性的測定陰離子氧生成量的測定均采用瞿偉菁、張志良的方法[21]：分別是愈創木酚比色法和羥胺法。

1.4 數據處理

試驗數據的記錄和計算用Microsoft Excel 2003；數據的處理和統計分析用SPSS 軟件(13.0 版本)完成。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對荊芥種子萌發和幼苗性狀的影響

2.1.1 NaCl脅迫對萌發率、子葉展開和種皮脫落的影響

根據種子在鹽脅迫下的萌發率和幼苗生長指標可以評價萌發期的耐鹽性。由表1可以看出，在脅迫處理一天后的萌發率隨著脅迫濃度的升高而降低，低濃度(25～50 mmol/L)NaCl脅迫對一天后的萌發率影響較小，分別比對照組下降了2.65%和1.78%，未達到顯著程度。NaCl在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的脅迫濃度下，分別比對照組下降了39.82%、66.37%、88.51%，差異顯著(P<0.05)。在第二天到第八天，各處理組的萌發率相近，無明顯變化，并與對照組的萌發率差異不顯著。說明在這期間鹽脅迫對荊芥種子的萌發并無明顯影響，進一步說明荊芥種子萌發期的耐鹽性高，不易受到鹽堿地的迫害。

在不同濃度NaCl溶液脅迫下，處理組的子葉展開數及種皮脫落數均低于對照組，分別比對照組減少13.89%、30.56%、96.29%、100%、100%和10.65%、20.78%、96.29%、100%、100%，隨著脅迫濃度的增大而減少，且差異顯著(P<0.05),以致最后兩組的子葉展開數和種皮脫落數均為0。說明鹽脅迫對荊芥幼苗的生長存在著明顯的抑制作用，即使得荊芥幼苗發育緩慢，濃度越大，生長越緩慢，脅迫濃度在100 mmol/L及之后荊芥停留在種胚階段而無幼苗生長。

表1 NaCl脅迫下荊芥種子萌發及幼苗生長指標的影響

注：表中數值為三次重復的平均值±標準誤差，字母表示相同天數不同NaCl濃度下萌發率、子葉展開率及種皮脫落百分數在P<0.05水平上的顯著性差異。

2.1.2 NaCl脅迫對根長、芽長、鮮重的影響

從圖1可以看出，根長和芽長均比對照組中的數值小(根長：2.063 cm、2.008 cm、0.582 cm、0.112 cm、0.117 cm、0.093 cm；芽長：2.108 cm、1.923 cm、0.957 cm、0、0、0)，且基本隨著NaCl濃度的升高而下降，根長及芽長分別比對照組下降2.67%、71.79%、94.57%、94.33%、95.49%和8.78%、54.6%、100%、100%、100%，在第3個脅迫濃度(100 mmol/L)已沒有芽的的形成，且第3個濃度之后根長的降低趨于平穩，說明低濃度的NaCl(<100 mmol/L)萌發的種子，鹽脅迫下具有根和芽的生長，高濃度的NaCl(≥100 mmol/L)溶液中的種子，雖能夠萌發(以突破種皮為標準)，但在鹽溶液中很難有芽的的形成，說明鹽脅迫對根和芽的生長存在明顯的抑制作用，且對芽的抑制較強。

由圖2可以看出，處理組的荊芥植株鮮重均比對照組小(0.016 14 g、0.015 17 g、0.008 69 g、0.006 16 g、0.005 98 g、0.006 41 g)，基本隨著脅迫濃度的增加株重逐漸下降，分別比對照組下降6.01%、46.16%、58.49%、62.95%、60.29%，說明鹽脅迫對生長物質的積累存在抑制作用，即鹽脅迫使得生長緩慢，有機物質積累減少，不利生長。

圖1 NaCl脅迫對根長和芽長的影響

圖2 NaCl脅迫對荊芥鮮重的影響

2.1.3 NaCl脅迫對荊芥成苗率的影響

鹽脅迫對荊芥植物體的傷害程度可以通過成苗率(73.95%、70.26%、66%、6.2%、0.94%、0.43%)直觀的表現出來。由圖3可見，處理組的成苗率均低于對照組，分別是較對照組下降了4.99%、10.75%、91.62%、98.73%、99.42%，隨著脅迫濃度的增高成苗率不斷下降。說明NaCl抑制幼苗的生長，使得荊芥生長停滯或死亡。其次，可以看出，在100 mmol/L、150 mmol/L和200 mmol/L的脅迫濃度下，荊芥成苗率逐漸降低，并顯著(P<0.05)低于25 mmol/L和50 mmol/L脅迫濃度下的成苗率，說明從100 mmol/L開始，鹽脅迫的危害達到極大，到200 mmol/L時，3個重復組中的300粒種子中只一株幼苗，其它植株或只萌發不成苗，或不萌發。

2.2 NaCl脅迫對荊芥植物體生理指標的影響

2.2.1 NaCl脅迫對SOD活性的影響

圖4顯示了荊芥在不同NaCl濃度脅迫下SOD活性基本變化趨勢(455.88、463.46、345.58、285.13、245.71、163.39 U/g)。與對照組相比，低濃度NaCl(25 mmol/L)脅迫下，SOD活性較高，較對照組高出1.64%，即脅迫環境下導致植株產生SOD,以清除不良環境致使植株產生的過多的活性氧自由基。脅迫濃度在25 mmol/L以上的處理組SOD活性均比對照組小，分別較對照組下降24.19%、37.46%、46.1%、64.16%，且與對照組相比均是差異顯著(P<0.05)。另外，隨著脅迫濃度的升高，SOD活性逐漸降低，即SOD活性隨NaCl濃度的增高呈現先升后降的變化趨勢，說明高濃度的NaCl抑制植株生長，過多的活性氧自由基積累抑制了SOD的活性。

圖3 NaCl脅迫對荊芥植物體成苗率的影響

圖4 NaCl脅迫對SOD活性的影響

2.2.2 NaCl脅迫對POD活性的影響

圖5 NaCl脅迫對POD活性的影響

圖6 NaCl脅迫對陰離子氧生成量的影響

2.2.3 NaCl脅迫對陰離子生成量的影響

圖6顯示NaCl脅迫下陰離子氧生成量變化趨勢(8.704 9、3.442 8、9.295 5、17.669 1、25.624 8、30.249 4 nmol/g·min)。在不同濃度梯度的NaCl脅迫下，陰離子氧生成量呈現先降后升的變化趨勢。在25 mmol/L的NaCl脅迫下，陰離子氧生成量較對照組低60.45%，說明荊芥植株對脅迫的響應使得體內產生清除陰離子氧的酶活性增強。在50 mmol/L及之后的濃度脅迫下，其陰離子氧生成量分別是對照組的1.07倍、2.03倍、2.94倍、3.47倍。100 mmol/L、150 mmol/L、200 mmol/L的NaCl脅迫下，陰離子氧生成量與對照組相比均為差異顯著(P<0.05)。說明高濃度的NaCl脅迫嚴重影響荊芥植物體的代謝，導致清除陰離子氧的活性酶減少，陰離子氧含量上升，危害植物體的生長。

3 總結

種子萌發率作為衡量種子活力的指標之一，可以反映出荊芥種子耐鹽性的高低。通過對荊芥種子萌發實驗的數據分析，可以看出NaCl脅迫對種子的萌發并無明顯影響。該結果與王桔紅和陳文對黑鍋枸杞的研究[22]中種子萌發對NaCl脅迫非常敏感的結論不一致。這可能是由于荊芥種子外包裹的白色粘膜對種子的保護作用，使得種子免于不良環境的影響，提高了種子萌發時期的耐鹽性，使種子不易受到鹽堿地的傷害，因此，處理組的萌發率與對照組差異不顯著。

對于已萌發的荊芥種子而言，NaCl脅迫對其胚根、胚芽及鮮重等各種生物量指標均有不同程度的影響。研究表明，對芽的抑制能力強于對根的抑制能力，并隨著濃度的升高，其影響越來越顯著，當脅迫濃度大于50 mmol/L時尤為顯著，在之后濃度脅迫中，已無胚芽出現。同時，鮮重也隨著脅迫濃度的升高而降低。這與喬紹俊等對紫蘇的研究[17]結果一致?？赡苁荖aCl脅迫導致荊芥組織細胞出現生理性缺水，也可能是高濃度的鹽脅迫導致質膜選擇透過性降低而使得Na+和Cl-在細胞內大量積累，導致代謝紊亂[23]。

大量研究表明, 植物抗性與其體內保護酶系統對活性氧的清除能力直接相關[24]。研究結果表明，NaCl脅迫下，荊芥植株的SOD、POD等抗氧化酶活性都發生了明顯的變化。都在25 mmol/L脅迫時較對照組出現相應的升高，而在之后較對照組出現逐步降低的趨勢。這說明受低濃度NaCl脅迫的荊芥植株SOD、POD能夠協同作用，使活性氧的量維持在一個低水平上，降低陰離子氧對植株的傷害，也即降低NaCl脅迫對植株的傷害，而隨著脅迫濃度增高，則影響到荊芥自身物質的合成，導致SOD和POD活性降低，這與李影麗等對舟山新木姜的研究[25]結果相似。因此，陰離子氧的生成量也出現相應(先降后升)的變化趨勢。

[1] 魏謙曉．我國鹽漬土的成因及其硫酸鈉含量計算[J]．中國石油和化工標準與質量，2013(14)：23-23．

[2] 楊莉琳，李金海．我國鹽漬化土壤的營養與施肥效應研究進展[J]．中國生態農業學報，2001，9(2)：79-81．

[3] 孟凡娟，龐洪影，王建中，等．NaCl和Na2SO4脅迫下兩種刺槐葉肉細胞葉綠體超微結構[J]．生態學報，2011，31(3)：734-741．

[4] 徐 威，王 瑜，袁慶華．NaCl脅迫對白三葉生長及保護酶的影響[J]．草地學報，2011，19(3)：492-496．

[5] 徐 晨，凌風樓，徐克章，等．鹽脅迫對不同水稻品種光合特性和生理生化特性的影響[J]．中國水稻科學，2013，27(3)：280-286．

[6] 孫 璐，周宇飛，李豐先，等．鹽脅迫對高粱幼苗光合作用和熒光特性的影響[J]．中國農業科學，2012，45(16)：3265-3272．

[7] 許耀照，曾秀存，方 彥，等．鹽堿脅迫對油菜種子萌發和根尖細胞有絲分裂的影響[J]．干旱地區農業研究，2014，32(4)：14-19．

[8] 王樹鳳，胡韻雪，孫海菁，等．鹽脅迫對2種櫟樹苗期生長和根系生長發育的影響[J]．生態學報，2014，34(4)：1021-1029．

[9] 錢 雯，單鳴秋，丁安偉．荊芥的研究進展[J]．中國藥業，2010，19(22)：17-20．

[10]趙立子，魏建和．中藥荊芥最新研究進展[J]．中國農學通報，2013，29(4)：39-43．

[11]楊忠國，楊勇明，楊海明．科星特大葉荊芥[J]．蔬菜，2004(1)：43-43．

[12]李秀霞，翟登攀，崔 志，等．水楊酸對NaCl脅迫下水稻種子萌發和幼苗生長的影響[J]．佳木斯大學學報(自然科學版)，2003，21(1)：49-51．

[13]張吉立，馮志紅．Na2SO4和CaCl2脅迫對黃瓜種子萌發和幼苗影響的研究初報[J]．吉林農業大學學報，2005，27(2)：175-178, 193．

[14]張錦偉，譚學林，許 鍵．不同濃度NaCl溶液對水稻不同品種(系)幼苗生長的影響[J]．植物遺傳資源學報，2004，5(1)：100-104．

[15]于泉林．NaCl對水稻不同品種發芽和幼苗生長的影響[J]．種子，2003，22(3)：41-42, 54．

[16]中華人民共和國國家標準,農作物種子檢驗規程GB 3543[S].北京:中國標準出版社,1995.

[17]喬紹俊，李會珍，張志軍，等．鹽脅迫對不同基因型紫蘇種子萌發、幼苗生長和生理特征的影響[J]．中國油料作物學報，2009，31(4)：499-502, 508．

[18]尹增芳，何禎祥，王麗霞，等．NaCl脅迫下海濱錦葵種子萌發和幼苗生長過程的生理特性變化[J]．植物資源與環境學報，2006，15(1)：14-17．

[19]段才緒，何 平，謝英贊，等．鹽脅迫對決明種子萌發和幼苗生理特性的影響[J]．西南師范大學學報(自然科學版)，2013，38(2)：73-78．

[20]王學奎.植物生理生化原理與技術[M].(第二版)高教出版社,2006.

[21]張志良，瞿偉菁，李小方．植物生理學實驗指導[M]．4版．北京：高等教育出版社，2009．

[22]王桔紅，陳 文．黑果枸杞種子萌發及幼苗生長對鹽脅迫的響應[J]．生態學雜志，2012，31(4)：804-810．

[23]程大友，張 義，陳 麗．氯化鈉脅迫下甜菜種子的萌發[J]．中國糖料，1996(2)：21-23．

[24]李志萍，張文輝．NaCl脅迫對栓皮櫟幼苗生長及其生理響應[J]．西北植物學報，2013，33(8)：1630-1637．

[25]李影麗，汪奎宏，許利群，等．舟山新木姜子鹽脅迫下生長變化及生理反應[J]．浙江林業科技，2008，28(2)：48-51．

Effect of NaCl stress on germination and seedling′s antioxidant enzymes activity of Nepeta cataria L.

ZHANG Rui-e1，WANG Juan1，WANG Zhi-ying1，DOU Li-jun1，LIU Xiao-li1，2*

(1.SchoolofBiologyandFoodEngineering,FuyangNormalUniversity,FuyangAnhui236037,China；2.EngineeringTechnologyResearchCenterofAnti-agingChineseHerbalMedicine,FuyangAnhui236037,China)

By the method of filter paper cultivation, some biomass indexes including germination rate, radical length, germ length, fresh weight and some physiological indexes were studied to explore the influence of NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress on seed germination and seedling growth of Nepeta cataria L..The results showed that effects on seed germination rate was not significant under NaCl(0 mmol/L, and 25 mmol/L, and 50 mmol/L, and 100 mmol/L, and 150 mmol/L, and 200 mmol/L) stress,while these indexes including root length, bud length, fresh weight, the number of cotyledons opened and seed coat drop decreased with the increasing of NaCl concentration, when the concentrations is higher than 100 mmol/L the inhibition was significant. When concentration of NaCl was 25 mmol/L, SOD and POD activity was higher than the control group, while under subsequent stress, concentration activity was lower than the control group, and the anionic oxygen generation showed a corresponding upward trend after the first drop.

NepetacatariaL.; NaCl stress; germination abilities; physiological index; antioxidant enzymes

2015-02-28

安徽省教育廳自然科學一般項目(KJ2013B200)；阜陽師范學院自然科學重點項目(2015FSKJ03ZD)；阜陽師范學院自然科學一般項目(2012FSKJ03，2013FSKJ18)資助。

張瑞娥(1976-)，女，碩士，講師，研究方向：植物營養與逆境生理。

劉小麗(1967-)，女，博士，副教授，研究方向：藥用植物學，Email:Liu-x-l2002@sina.com。

Q945.78

A

1004-4329(2015)03-059-06

10.14096/j.cnki.cn34-1069/n/1004-4329(2015)03-059-06