T LR 4在大腸桿菌引發的奶牛子宮內膜炎中的作用

趙立香，郭夢堯，李豐陽，梁德潔，張乃生

（1.吉林農業科學技術學院制藥工程學院，吉林 吉林 132101；2.吉林大學動物醫學學院，吉林 長春 130062）

奶牛子宮內膜炎是危害奶牛養殖業的重要疾病，主要導致子宮復舊時間延長、受孕率下降，母牛淘汰率升高，給奶牛養殖業造成了巨大的經濟損失。奶牛子宮內膜炎的發生是病原微生物與奶牛自身免疫狀態及遺傳因素等作用的結果[1]。先天免疫系統首先識別侵入機體的病原，然后信號傳導通路，誘導相關免疫細胞的活化和細胞因子分泌，啟動獲得性免疫應答，殺滅致病菌。病原相關分子模式（PAMP）識別受體可對入侵病原菌識別，是先天免疫反應以及獲得性免疫反應的基礎[2]。近年來發現，Toll樣受體（Toll-like recep?tor，TLR）就是一類PAMP識別受體。TLR4可以識別革蘭陰性菌細胞壁成分，進而激活下游分子和細胞因子的分泌[3-4]。大腸桿菌是革蘭陰性菌，主要引發臨床型子宮內膜炎[5]，但其引發奶牛子宮內膜炎的機制仍不清楚。本研究以先天免疫反應中的TLR4為切入點，研究大腸桿菌引發奶牛子宮內膜炎的致病機制。這將有助于對奶牛子宮內膜炎的防控及治療。

1 材料

1.1 試驗動物 健康中國荷斯坦母奶牛10頭，體溫正常，食欲旺盛，直腸檢查：子宮角直徑明顯縮小，子宮壁彈性良好。由吉林省吉林市規范化養牛養殖場提供。

1.2 藥品 雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、Tris、尿素、EDTA，均購自Promega生物技術有限公司；甲酰胺、TEMED，購自Sigma生物有限公司；PBS、H2SO4、冰醋酸，購自上?；瘜W試劑公司。

1.3 主要試劑 組織蛋白提取試劑盒、cDNA合成試劑盒、組織RNA提取試劑盒、ELISA檢測試劑盒，均購自寶生物工程（大連）有限公司；SYBR Green Premix Ex Tag試劑盒、TBST、脫脂乳，購自Sigma生物有限公司。

1.4 主要儀器 臺式高速離心機，購自上海天美科學儀器公司；半干轉膜儀、凝膠電泳成像系統、酶標儀，均購自美國伯樂生物有限公司；水平電泳槽，購自北京君意電泳儀設備廠；熒光定量PCR儀，購自ABI生物有限公司；勻漿器、搖床，購自上海六一儀器廠。

2 方法

2.1 動物模型建立 選取中國荷斯坦奶牛10頭。其中，2頭不做處理（A），4頭子宮灌注無菌的LB肉湯培養基（B），4頭子宮灌注大腸桿菌菌液（C）。7～10 d后，灌注細菌組臨床表現為：精神沉郁，體溫升高，采食減少，由陰門流出灰褐（白）色有腐臭味的黏液，子宮頸口周圍有膿性分泌物附著，直腸檢查：子宮角松軟、增粗，子宮壁增厚，彈性減弱等。對照組A和無菌的LB肉湯培養基B組奶牛無異常臨床表現。

2.2 子宮內膜樣品采集 利用子宮內膜活檢采樣器采集子宮內膜樣品。將已經無菌處理的采樣器以直腸把握法送入子宮內。經直腸用手將子宮壁用力按壓到采樣器的凹口，閉合采樣器，切下子宮內膜組織，再取出采樣器，將子宮內膜樣品放于已滅菌的小瓶中，以備實驗檢測。

2.3 TNF-α、IL-1β、IL-6檢測 子宮內膜樣品組織勻漿后，12000 r/min離心收集上清液。ELISA板一抗包被，4℃過夜。洗板液清洗4次，注入樣品稀釋液（200μL/孔），室溫振蕩1 h。加入待測樣品100 μL，20℃振蕩2 h，PBS洗板3次，加入二抗，洗板3次，之后加入顯色液，用濃度2 mmol/L H2SO4100μL注入各孔以終止顯色。用酶標儀測定OD450nm值，根據已經繪制的標準曲線計算濃度。

2.4 實時熒光定量PCR分析 利用組織RNA提取試劑盒提取子宮黏膜總RNA。通過測定OD260值檢測RNA的濃度，瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性。依據TaKaRa公司反轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈。

cDNA樣品梯度稀釋后構建標準曲線，線性回歸分析。利用real-time PCR反應的S動力學曲線和解離曲線檢測方法是否可靠。使用SYBR Pre?mix Ex Tag試劑盒，25μL體系進行實時熒光定量PCR：上、下游引物（10 pmol/μL）各1μL，模板cD?NA 2.5μL，Rox Reference DyeⅡ1.7μL，緩沖液11 μL，滅菌雙蒸水7.8μL。反應條件為：95℃35 s；95℃ 5 s，60 ℃ 40 s，60 ℃ 40 s，40個循環。每個樣品3個重復孔，采用相對定量法分析結果。

2.5 Western Blot分析 子宮黏膜組織勻漿后，加入預先裂解液，置于搖床緩慢震蕩5 min，然后10000 r/min（4℃）離心20 min，取上清液進行SDS-PAGE分析，并用半干轉膜儀轉膜，50 g/L脫脂乳封閉2 h，然后4℃，孵育一抗，過夜。TBST漂洗4次，每次5 min，孵育二抗?；瘜W發光ECL顯色，觀察。

3 結果

3.1 炎性細胞因子分泌情況 將收集到的子宮內膜樣品標記后，利用勻漿器進行組織勻漿。12000 r/min離心后收集上清液，棄去沉淀。按照TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA試劑盒說明書操作進行測定。用酶標儀測OD450nm值，根據標準曲線計算各組樣品中TNF-α、IL-1β、IL-6的濃度。結果如圖1所示。大腸桿菌刺激后，炎性因子均明顯上升。TNF-α、IL-1β變化尤為明顯，分泌量增加（P＜0.05）。IL-6也有所升高，但變化不大（P＜0.05）。子宮灌注無菌的液體培養基實驗組TNF-α、IL-1β、IL-6略微有所增多，但無明顯統計學意義。

圖1 炎性細胞因子分泌水平

3.2 TLR4基因及蛋白表達變化 TLR4是識別革蘭陰性菌的主要受體蛋白。試驗結果顯示，大劑量的大腸桿菌作用于牛的子宮內膜組織，TLR4 mRNA表達水平明顯升高（如圖2a所示）。進一步對TLR4蛋白表達進行分析，與A、B組相比，C組大腸桿菌刺激能明顯地增加TLR4蛋白的表達（P＜0.05）。表明大腸桿菌刺激能促進TLR4 mRNA及LR4蛋白的表達（如圖2b所示）。

圖2 TLR4基因及蛋白表達水平

3.3 NF-κB信號通路的影響 NF-κB信號通路與炎癥關系非常緊密，是TLR4下游的關鍵調控節點。為進一步研究大腸桿菌的致炎機制，對NF-κB信號通路進行檢測。試驗結果顯示，給予大腸桿菌刺激牛的子宮內膜組織后，NF-κB mRNA表達水平明顯升高（如圖3a所示），其抑制蛋白I-κB mRNA表達也明顯升高（見圖3b）。對NF-κB蛋白分析發現，大腸桿菌對NF-κB蛋白表達無影響，但會促進NF-κB磷酸化。相對應的，大腸桿菌刺激明顯地增加了I-κB磷酸化蛋白的表達（P＜0.05）。表明大腸桿菌刺激NF-κB蛋白磷酸化，并促進I-κB與NF-κB蛋白的解離，從而減少其抑制作用（如圖4所示）。

4 討論

圖3 NF-κB與I-κB基因表達水平

圖4 NF-κB信號通路蛋白表達水平

大腸桿菌引發急性子宮內膜炎與TLR4密切相關。子宮內膜組織TLR4發揮對大腸桿菌的識別作用，受到大腸桿菌刺激后TLR4表達增加。進一步激活NF-κB信號通路的NF-κB蛋白磷酸化及I-κB與NF-κB蛋白的解離，NF-κB入核啟動相關因子基因，從而導致TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性細胞因子表達增多。由于這種刺激呈現暴發式的反映效果，所以患牛在TNF-α、IL-1β、IL-6作用下，表現出典型的臨床癥狀。

5 結論

結果表明，奶牛子宮內膜組織表達TLR4受體。大腸桿菌引發奶牛子宮內膜炎過程與TLR4的作用密切相關，其導致的信號通路活化和炎性細胞因子的分泌，可能受到TLR4的調節。大腸桿菌刺激后，炎性因子均明顯上升。TLR4基因及蛋白表達、NF-κB蛋白磷酸化都有所增強。

[1]李世宏，楊國林，楊銳樂，等.奶牛子宮內膜炎研究進展[J].中國奶牛，2007，1：34-38.

[2]Liu G，Zhang L，Zhao Y.Modulation of immune responses through direct activation of Toll-like receptors to T cells[J].CLIN EXP IMMUNOL，2010，160（2）：168-175.

[3]Bellocchio S，Moretti S，Perruccio K，et al.TLRs govern neutrophil activity in aspergillosis[J].J Immunol，2004，173（12）：7406-7415.

[4] Murphy T J，NI Choileain N，Zang Y，et al.CD4+CD25+regulatory T cells control innate immune reactivity after injury[J].J Immu?nol，2005，174（5）：2957-2963.

[5]趙紅霞，李培鋒，吳聰明，等.奶牛子宮內膜炎大腸桿菌的分離血清型鑒定及其耐藥性測定[J].中國獸醫雜志，2009，45（4）：22-23.