肉雞鸚鵡熱衣原體病原微生物的實驗室分離鑒定

段延軍 張小麗

(1甘肅農業大學動物醫學院730070；2中農威特生物科技股份有限公司730000)

衣原體病是由衣原體（Chlamydia）引起畜禽、野生動物和人類發生感染以流產、肺炎、支氣管炎、胃腸炎、結膜炎、關節炎、腦脊髓炎為主要病理特征的疾病。鸚鵡熱衣原體?。ˋA Chlamydiosis，AC）是一種接觸性傳播的人獸共患。在自然條件下肉雞可以感染本病，表現出沉郁、呼吸困難、食量下降，常呈惡病質狀態，最終因衰竭而導致死亡，耐過的病雞表現生長受阻[1]。本研究采集某肉雞養殖場疑似鸚鵡熱衣原體病的組織病料，進行病原微生物的分離鑒定。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

病雞：采集某養殖場肉雞群；SPF雞胚購自北京實驗動物中心。

1.2 試劑

衣原體單克隆熒光抗體診斷試劑盒（軍事醫學科學院微生物檢驗研究中心）；

衣原體病間接血凝（IHI）診斷試劑盒（湖北畜牧獸醫研究所）；

姬姆薩染液；碘染液。

1.3 方法

1.3.1 血清學檢測

采取疑似鸚鵡熱衣原體病肉雞血清，使用衣原體病間接血凝試驗診斷試劑盒操作說明書進行血清學試驗，根據試劑盒提供的標準判斷血凝反應程度。

1.3.2 樣品采集

根據病雞臨床癥狀和病理變化，取病變嚴重的肺臟、肝臟、氣管、腎臟、心臟等病料，分為兩份，一份用于雞胚接種，一份用于臟器壓片和細菌培養。

1.3.3 臟器壓片檢查

取采集的病料組織作壓片后使用姬姆薩染色，鏡檢，觀察包涵體。

1.3.4 細菌培養

將采集的病料組織接種于普通瓊脂、麥康凱瓊脂和血液瓊脂培養基中，置于37℃恒溫箱培養24h，觀察細菌生長情況，挑取疑似菌落，涂片染色鏡檢，生化鑒定。

1.3.5 SPF雞胚接種和傳代

無菌采集明顯臨床癥狀病雞的肺臟組織，充分研磨后加入200ug/ml鏈霉素，50ug/ml慶大霉素，100ug/ml萬古霉素，加入生理鹽水制成20%混懸液，2000r/min離心10min，取上清接種于7日齡SPF雞胚卵黃囊腔中，0.3ml/枚，37℃孵育，逐日觀察雞胚病變情況，棄去3d內發生死亡的雞胚，取4-6d死亡的雞胚卵黃囊，壓片，用熒光抗體標記的抗衣原體單克隆抗體染色，鏡檢衣原體的包涵體。

將分離培養的卵黃囊膜做涂片，甲醇固定3min，碘染色溶液染色10min，水洗，吸干，油鏡下觀察結果。

2 結果

2.1 臨床癥狀和病理剖檢

病雞多呈隱形經過，食欲減退，精神沉郁，漸進性消瘦，呼吸困難，頻繁張嘴呼吸，喜蹲臥，眼臉腫脹，流淚，鼻孔內流出大量膿性或漿液性鼻液。剖檢發現病變主要集中在肺臟、氣囊、肝臟和腎臟上，重癥者肺臟出現單側或雙側纖維素性滲出物，肺邊緣粘連，單側或雙側氣囊混濁，肝臟顏色變淡，偶爾發現壞死灶，后期出現肝周炎，氣管喉頭有大量粘液，腎臟腫大出血。

2.2 血清學檢測

本次共采集疑似鸚鵡熱衣原體病雞血清81份，血清學調查結果顯示，臨床上15～20日齡的肉雞最乙肝，死亡雞群主要集中在30～39日齡，發病率30%左右，死亡率10%左右，病程長約14～20d。

2.3 肺臟壓片檢查

在熒光顯微鏡下課見與抗衣原體熒光單克隆抗體反應，觀察到亮綠色衣原體包涵體。

2.4 細菌培養

在普通培養基上發現一些無色光滑、顆粒樣菌落，麥康凱培養基上長出亮紅色，向培養基內凹生長的菌落，經染色鏡檢和生化鑒定，生長出的菌落為大腸桿菌。

2.5 SPF雞胚接種

盲傳三代4～6d規律性死亡的雞胚胚體充血、出血，雞胚頭、頸、背部出現明顯的出血斑，卵黃膜變薄，尿囊液清澈，囊膜水腫，取雞胚卵黃囊膜壓片，經熒光抗體標記的抗衣原體單克隆抗體染色后再熒光顯微鏡下可以觀察到亮綠色熒光圓形顆粒，可判斷為衣原體感染陽性。

3 討論

國外許多學者認為雞對鸚鵡熱衣原體具有一定的抵抗力，自然感染的雞常呈隱形或一過性感染，很難分離到衣原體，而且血清學檢測陽性率比較低，幼雞急性感染后可能出現死亡。后來有學者報道，由于雞衣原體IHI抗體應答發生比較遲，雞衣原體實際感染率要遠遠高于血清學陽性檢出率[2]。本研究對某肉雞場疑似鸚鵡熱衣原體病雞血清進行檢測發現該肉雞場感染情況普遍發生，發病率在25～30%左右，死亡率在10%左右，調查結果與文獻報道一致[3]。

在雞胚接種過程中，不同來源和不同批次的SPF雞胚對同一鸚鵡熱衣原體的敏感性不同，引發雞胚致死率也有差異。研究結果顯示，該菌株在細菌培養基上不聲張，使用姬姆薩和熒光標記抗衣原體單克隆抗體染色接種雞胚卵黃囊膜，在熒光顯微鏡下可以看到衣原體顆粒。在本次菌株分離的過程中還分離到了大腸桿菌，因此在臨床上診斷時要注意鸚鵡熱衣原體和大腸桿菌病混合感染的情況，并注意做出鑒別診斷。

[1]唐國芳,陳麗麗,劉良專,等.鸚鵡熱嗜衣原體禽鳥株的分離鑒定及小鼠呼吸道感染模型的建立[J].微生物學報,2010,50(12):1657-1663.

[2]石巖,何誠,朱虹,等.肉雞鸚鵡熱衣原體的分離和鑒定[J].中國比較醫學雜志,2003,13(4):217-220.

[3]王爭強,朱虹.鸚鵡熱嗜衣原體檢測和診斷方法研究進展[J].微生物學免疫學進展,2005,33(2):75-78.