珙桐未成熟胚的萌發及植株再生的研究*

方志榮，蔡光澤

(西昌學院，四川 西昌615013)

珙桐未成熟胚的萌發及植株再生的研究*

方志榮，蔡光澤

(西昌學院，四川 西昌615013)

為了建立珙桐的再生體系，試驗以珙桐未成熟胚為外植體，獲得了再生植株。采用正交設計和極差分析法對影響未成熟胚再生植株的四種主要因素α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid,NAA）、噻苯隆(Thidiazuron,TDZ)、赤霉素(gibberellic acid,GA)和活性炭(active carbon,AC)進行了研究。結果表明：胚萌發的最佳培養基組合為WPM+0．09 mg/L NAA +0．6 mg/L TDZ+0．9 mg/L GA+0．8 g/L AC，芽誘導率為71．43%；萌發胚芽分化及生根的最佳培養基組合為WPM培養基+ 0．1 mg/L NAA+3 mg/L TDZ+6 mg/L GA+1．2 g/L AC，再生率為50%。AC能促進下胚軸變綠和子葉變綠，NAA、GA對解除胚的形態后熟有重要作用。GA和TDZ在芽分化及生根過程中起主導作用。

珙桐；未成熟胚；再生植株

珙桐(Davadia involucrataBaill)又名鴿子樹，為我國特有的珙桐科(Davadiaceae)單型屬植物。系第三紀古熱帶植物區系的孑遺種，有“活化石”之稱，是世界著名的觀賞植物，被列為國家一級珍稀瀕危保護植物[1]。珙桐天然分布在我國的貴州、湖南、湖北、陜西、四川、云南以及甘肅7省，7省內分布范圍較窄，資源量較少，僅限于一些邊遠山區人跡罕到之處[2]。

在自然狀態下，珙桐種子休眠期長，萌發率低，存在二次休眠，其中種胚的形態后熟和生理后熟是種子休眠的主要原因[3,4]。新采收的珙桐種子必須在濕砂中層積近2年才能逐漸分化成具有纖毛和葉脈的胚芽，完成形態后熟。此后大部分種子進入二次休眠，須繼續層積2年，才能迅速萌發[3]。利用成熟期果實中的未成熟胚為外植體，采用加入外源激素的辦法可以縮短未成熟胚完成形態后熟的時間，實現未成熟胚萌發[5,6]。然而，迄今為止尚無利用珙桐成熟前期果實中的未成熟胚直接再生植株并無報道。

本研究以珙桐成熟前期果實中的未成熟胚為材料，研究了以珙桐未成熟胚為外植體直接再生植株的培養基配方，以期為研究珙桐未成熟胚的后熟提供材料，為珙桐未成熟胚再生體系激素配方的研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2012年9月1日于四川省雅安市滎經縣龍蒼溝(海拔:1530 m,N 29.33°,E 102.44°)采集珙桐當年生果實，帶回實驗室后4℃保存。

表1 正交設計試驗因素與水平

1.2 研究方法

1.2.1 培養基的篩選

本實驗共分為兩個階段，第一階段先誘導未成熟胚萌發；第二階段誘導芽分化及生根。以WPM培養基為基礎培養基，采用正交設計法對影響珙桐胚培養的四種主要因素α-萘乙酸（ α-Naphthaleneaceticacid,NAA）、噻 苯 隆(Thidiazuron,TDZ)、赤霉素(gibberellic acid,GA)和活性炭(active carbon,AC)進行研究，試驗因素及水平設置見表1。試驗方案及結果分析見表2，表3。

1.2.2 接種及培養試驗

剝去珙桐果實的外果皮和中果皮后，用小鐵錘小心敲開內果皮，從果核深溝里再小心挑出種子，剝去胚乳，將未成熟胚置于純水中浸泡30分鐘。在超凈工作臺上，先用75%乙醇滅菌20秒，無菌水沖洗3～4次，再用0.1%的升汞滅菌40秒，無菌水沖洗5次以上。將上述滅菌后的未成熟胚接種于含不同濃度激素的胚萌發培養基上。每瓶接2個胚，每組8瓶。將培養物放入人工氣候箱中光照16 h，黑暗8 h，溫度25℃培養。以上胚軸開始出現肉眼可見的芽為萌發的標準，30天后統計胚的萌發率。萌發率=(未污染萌發胚數/未污染總胚數）x100%。將未污染的萌發的胚轉接到芽分化及生根培養基上。每瓶接1個胚，每組12瓶。

2 結果與分析

2.1 未成熟胚芽誘導、芽分化及生根

圖1 珙桐未成熟胚的萌發及植株再生

有關珙桐休眠的原因主要有3種：（1）內果皮（圖1①）堅硬，透水性和透氣性差，及機械阻力造成珙桐種子休眠[4]。（2）未成熟胚的形態后熟和生理后熟是造成種子休眠的另一重要原因[3]。余阿梅等采用在濕沙中沉積1年的未成熟胚為材料，以1/2 MS+ 0.5 mg/L IBA+1 mg/L BA+2.85 mg/L GA+0.25 mg/L AC為培養基誘導未成熟胚萌發，實驗中以幼根超過該胚的長度為萌發的標準，30天優化后的培養基萌發率為87.72%[5]。董社琴等以新采收珙桐果實的種胚為材料，未成熟胚4℃處理21天后進行培養，在培養后的56天發現MS+4.0 mg/L BA+12 mg/L GA+3 mg/L IAA培養基上的未成熟胚萌發[6]。本研究中，接種在芽誘導培養基上生長良好的白色胚（圖1②）10天以后下胚軸及子葉變成綠色（圖1③），30天后在上胚軸開始出現肉眼可見的芽（3 mm以上）（圖1④），未成熟胚萌發的時間與前人報道相比有所縮短，此時的胚已經完成形態后熟。（2）珙桐果實中含有大量的抑制種子萌發的物質是造成珙桐種子休眠的又一重要的原因。除果肉，內果皮和胚乳外，胚自身也含有抑制萌發的物質[7]。對珙桐生殖物候的研究表明，珙桐5月下旬形成幼果，10月中下旬果實成熟，并開始脫落[8]。本研究取材的時間處于果實的生長期，此時未成熟胚中含有的萌發抑制物質低于成熟期的萌發抑制物質，可能是未成熟胚發芽時間縮短的原因。完成形態后熟的胚在芽分化及生根培養基上繼續培養，則50天可以分化出芽（圖1⑤）及70天后產生再生植株（圖1⑥）。

表2 未成熟胚芽誘導培養基正交設計方案、結果及極差分析

2.2 不同因素組合對未成熟胚芽誘導的影響

未成熟胚芽誘導可以分為下胚軸變綠、子葉變綠和萌發三個階段（表1）。極差分析的結果表明，在三個階段中，活性炭（AC）發揮了重要作用。這一結果與余阿梅試驗結果一致，一定量的活性炭能吸附胚中的萌發抑制物質[5]，然而過多的活性炭可能吸附培養基中的生長調節物NAA、TDZ、GA使未成熟胚芽誘導率下降。董社琴等報道了IAA對解除種子形態后熟有作用，GA對解除生理后熟至關重要[6]。從表1的分析可以得出：NAA在芽誘導的前期發揮了重要作用，到后期GA顯示出重要的作用。綜合表1的結果，可以得到優化后的培養基為WPM+0.09 mg/L NAA+0.3 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+0.8 g/L AC。

2.3 不同因素組合對萌發胚芽分化及生根的影響

陳坤榮等用GA和6-BA浸泡二次休眠的珙桐種子1周，可使珙桐種子在半個月內萌發出苗，說明珙桐種子完成形態后熟后，外源激素GA和6-BA對解除種子休眠至關重要[3]。雷濘菲等測定了珙桐種子休眠萌發過程中，內源激素的變化，發現在珙桐種子萌發的過程中，GA和KT的含量增加，NAA的含量也增加[9]。1976年德國先靈公司宣布TDZ (thidiazuron)合成，其化學名稱為N-苯基-N’-(1,2, 3-噻二唑-5基)-脲。國內定名為噻苯隆。噻苯隆是一種新型高效的細胞分裂素用于組培能更好的促進植物的芽分化，其誘導植物細胞分裂的作用是6-BA的100倍[10]。從表2的極差分析結果可以得出，在芽分化及生根的過程中GA和TDZ起到了重要的作用，與陳坤榮、雷濘菲等研究的結果一致[3,9]。然而，本研究所得到的發生芽分化及生根的成熟胚的比例偏小，這可能與加入的外源激素的量有關。增加外源激素的加入量是否能促進芽分化及生根有待進一步的研究證實。

表3 芽分化及生根培養基正交設計方案、結果及極差分析

3 結論與討論

本研究通過兩步法即芽誘導、芽分化及生根，實現了珙桐種子直接再生植株。α-萘乙酸（NAA）、噻苯隆(TDZ)、赤霉素(GA)和活性炭(AC)在再生植株形成的不同階段發揮的作用有所差異。在下胚軸變綠、子葉變綠階段，AC和NAA起了主導作用，GA在萌發階段開始起主導作用，這種作用一直持續到形成完整植株。在芽分化及生根的過程中，TDZ也成為決定芽分化的主要因素，此時活性炭變為一種次要因素。本研究取材的時間是9月初，未成熟胚中萌發抑制物尚少，是本研究較高的未成熟胚萌發率得以實現的前提條件，然而所取的珙桐果實在冰箱中放置時間超過兩周后，就會造成種子生活力嚴重下降，未成熟胚萌發率嚴重降低。因此采用此法獲得珙桐的再生植株，珙桐果實的保存是今后需要解決的問題。

通過本研究得到了芽誘導的最佳培養基0.09mg/L NAA+0.6 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+0.8 g/L AC+WPM培養基，此時未成熟胚萌發率為71.43%；芽分化及生根的最佳培養基為0.1 mg/L NAA+3 mg/ LTDZ+6 mg/L GA+1.2g/L AC+WPM培養基，此時再生植株的比例為50%。通過極差分析，得到了芽誘導階段的最佳培養基組合，然而由于材料的限制未能得到驗證。

鄒利娟等采用組織培養的方法成功的繁殖珙桐苗，且幼苗成活率高達60%[11]，因此作為快繁技術未成熟胚再生植株因為成本高，取材時間受限，及材料保存困難受到限制。然而本實驗的結果卻為研究珙桐胚的形態后熟和生理后熟提供了良好的材料。激素及萌發抑制物質的對胚的萌發及芽分化和生根的調控有待進一步的研究。

注釋及參考文獻：

[1]傅立國．中國植物紅皮書(第一冊)[M]．北京:科學出版社．1991:474-475．

[2]賀金生,林潔,陳偉烈．我國珍稀特有植物珙桐的現狀及其保護[J]．生物多樣性．1995,3(4):213-221．

[3]陳坤榮,李桐森,田廣紅,等．珙桐繁殖的生物學特性[J]．西南林學院學報,1998,18(2):8-13．

[4]萬朝琨．珙桐種子休眠的解剖學研究[J]．中南林學院學報,1988,8(1):35-39+114-115．

[5]余阿梅,蘇智先,王立強,等．珍稀瀕危植物珙桐胚的萌發與快速繁殖[J]．植物學報,2009,44(4):491-496．

[6]董社琴,李冰雯,王愛榮．植物生長調節劑對珙桐種胚離體培養的影響[J]．湖北農學院學報2004,24(4)：291-294．

[7]雷濘菲,蘇智先,陳勁松,等．珍稀瀕危植物珙桐果實中的萌發抑制物質[J]．應用與環境生物學報,2003,9(6):607-610．

[8]蘇智先,張素蘭．珙桐種群生殖物候及其影響因子研究[J]．四川師范學院學報(自然科學版),1999,20(4):4-9．

[9]雷濘菲,彭書明,牛蓓,等．珍稀瀕危植物珙桐種子休眠萌發過程中內源激素的變化[J]．廣西植物,2009,29(1):66-69+131．

[10]劉承德,成磊．新型植物生長調節劑噻苯隆機理作用及應用[J]．新疆農墾科技,2011,2:63-64．

[11]鄒利娟,蘇智先,胡進耀,等．瀕危植物琪桐的組織培養與植株再生[J]．植物研究,2009,29(2):187-192．

In Vitro Embryo Germination and Plant Regeneration from Immature Embryos of Davidia Involucrata Baill

FANG Zhi-rong,CAI Guang-ze
(Xichang College,Xichang,Sichuan 615013)

In order to obtain Davidia involucrata generation system,the immature embryos of D.involucrata were taken as explants,and regenerated plants were obtained.Four factors(α-Naphthaleneacetic acid[NAA], Thidiazyron[TDZ],gibberellic acid[GA]and active carbon[AC]affecting plant regeneration from immature embryos of D.involucrata were studied by use of orthogonal design and analyzed by range analysis.The results showed that: the best combination medium for embryo germination was WPM+0.09 mg/L NAA+0.6 mg/L TDZ+0.9 mg/L GA+1 g/L AC,and the germination rate were 71.43%.While the best combination medium for embryos grew into shoots and rooted was WPM+0.1 mg/L NAA+3 mg/L TDZ+6 mg/L GA+1.2 g/L AC,and the generation rates was 50%. AC could promote turning green of hypocotyls and cotyledon.NAA and GA were important to break after-ripening of embryo.GA and TDZ played a leading role in growing shoots and roots.

Davidia involucrate Baill;immature embryo;plant regeneration

Q943．1

A

1673-1891（2015）01-0007-04

2014-10-15

四川省教育廳項目（項目編號：08zb015）；西昌學院院自立項目（項目編號：ZZSSA0808）。

方志榮（1981-），女，講師，在讀博士，研究方向：植物學。