納米銀凝膠無菌檢查的直接接種法及對抑菌成分的干擾排除效果

崔曉博，劉旭，馬守棟，李明春

納米銀凝膠無菌檢查的直接接種法及對抑菌成分的干擾排除效果

崔曉博，劉旭，馬守棟，李明春＊

無菌檢查；納米銀凝膠；直接接種法

納米銀［1，2］由于體積及其微小，表面活性位置多，穿透力強，易于進入多種病原體的內部，從而達到破壞病原體，促進傷口愈合的作用。納米銀對細菌、真菌等都具有較強而持久的抑制作用，且不易產生耐藥。納米銀凝膠是筆者所在醫院開發研制的新劑型，由硝酸銀和卡波姆組成，主要用于治療燒燙傷，控制創面感染?！吨袊幍洹?010版二部附錄凝膠藥項下規定用于燒傷或嚴重創傷的凝膠藥，經無菌檢查法［3］檢查，應符合規定。此凝膠中含有大量賦形劑等高分子物質［4］，這些物質不易通過過濾膜，因此本品不宜采用薄膜過濾法，其無菌檢查應選用直接接種法，同時去除其抑菌成分對無菌檢查的干擾。

1　材料與方法

1.1儀器電熱恒溫水箱；SW-CJ-1F單人雙面凈化臺；隔水式電熱恒溫培養箱；生化培養箱。

1.2培養基硫乙醇酸鹽流體培養基，改良馬丁培養基，營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉培養基，無菌蛋白胨水溶液，0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.3菌種實驗菌株為白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，生孢梭菌［CMCC（B）64941］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4供試品納米銀凝膠（20 g/支，批號：20140310、20140311、20140312）

2　驗證方法

2.1菌液的制備接種金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中，接種生孢梭菌的新鮮培養物至硫乙醇酸鹽流體培養基中，30～35℃培養18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中，23～28℃培養24～48 h，上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數＜100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上，23～28℃培養5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數＜100 cfu的孢子懸液［4］。菌數的計算應用平板法，結果見表1。

表1　菌液培養結果

2.2培養基的靈敏度檢查取9支每管裝量為12 ml的硫乙醇酸鹽流體培養基，分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養3 d；取每管裝量為9 ml的改良馬丁培養基5支，分別接種＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，培養5 d。逐日觀察，培養的3～5 d中，空白對照管無菌生長，加入菌液管中細菌生長良好，判定該批硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基的靈敏度檢查符合規定。

2.3培養基的無菌性檢查取兩種培養基各5瓶，分別放置在各自的培養溫度下空白培養14 d，空白培養管均無菌生長。判該批硫乙醇酸鹽流體培養基、改良馬丁培養基的無菌性檢查符合規定。

2.4供試品溶液的制備取納米銀凝膠供試品4支（批號20140310），全部加至400 ml無菌氯化鈉蛋白胨中，攪拌使其完全溶解，作為供試品溶液。

2.5方法驗證試驗

2.5.1驗證方法一取硫乙醇酸鹽流體培養基8瓶（100 ml/瓶），分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌、生孢梭菌各2瓶，取改良馬丁培養基4瓶，分別接入＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各兩瓶，其中一瓶接入供試品10 ml，另一瓶做對照。結果見表2。

2.5.2驗證方法二硫乙醇酸鹽流體培養基的用量改為150 ml/瓶，其他操作同方法一，結果見表3。

2.5.3驗證方法三硫乙醇酸鹽流體培養基的用量改為200 ml/瓶，其他操作同方法一，結果見表4。

3　無菌檢查

取3批樣品，供試品的制備同驗證試驗，每批供試品取硫乙醇酸鹽流體培養基4瓶，其中兩瓶接入供試品10 ml，置30～35℃培養；一瓶接入無菌氯化鈉蛋白胨10 ml，置30～35℃培養，作為陰性對照；一瓶接入供試品10 ml和＜100 cfu的金黃色葡萄球菌1 ml［5］，置30～35℃培養，為陽性對照。取改良馬丁培養基3瓶，兩瓶接入供試品10 ml，置30～35℃培養；一瓶接入無菌氯化鈉蛋白胨10 ml，置30～35℃培養，作為陰性對照。

表2　驗證試驗結果（方法一）

表3　驗證試驗結果（方法二）

表4　驗證試驗結果（方法三）

4　結果

方法驗證結果見表2、3、4。三批供試品及陰性對照組培養14 d均未有菌生長，陽性對照組培養3 d，細菌生長良好。

5　討論

薄膜過濾法是檢查含抗菌成分藥物的一般方法，但納米銀凝膠中含大量的卡波姆，不易通過過濾膜，因此采用直接接種法對其進行檢查。但納米銀具有抑菌作用，在驗證方法一中，供試品組中細菌的生長相較于陽性對照組明顯較弱，說明納米銀對細菌的生長有抑制作用；在驗證方法二中，加大培養基的用量，減弱了納米銀凝膠的抑菌作用，但供試品組的細菌生長仍弱于陽性對照組；方法三中，繼續加大培養基的用量，每天進行密切觀察發現供試品組的細菌長勢與陽性對照組的細菌長勢基本相同，說明此方法中培養基用量可完全去除納米銀凝膠的抑菌作用。

所以在納米銀凝膠的無菌檢查中，筆者采用直接接種法并加大培養基的用量去除其抑菌作用以達到良好的效果?！緟⒖嘉墨I】

［1］施暢，徐麗明，邵安良.納米銀的毒理學研究現狀［J］.藥物分析雜志，2013，33（12）：2025-2033.

［2］孫倩，李明春，馬守棟.納米銀抗菌活性及生物安全性研究進展［J］.藥學研究，2013，32（2）：103-105.

［3］中華人民共和國藥典［S］.二部.2010版：附錄.

［4］丁有學，劉蘭，畢華，等.堿性成纖維細胞生長因子凝膠的無菌檢查［J］.中國藥事，2013，27（9）：932-934.

［5］江志杰，劉文杰，高春，等.左氧氟沙星注射液無菌檢查方法驗證［J］.中國藥品標準，2008，9（4）：245-247. ［2015-03-08收稿，2015-04-07修回］

［本文編輯：吳蓉］

R318.08

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266071山東青島，解放軍401醫院（崔曉博，劉旭，馬守棟，李明春）

李明春，Email：lmc401y@163.com