姚江水系中華鱉不同組織3種同工酶的表達差異

鄭小青　梅依霞　洪炆飛　汪財生　唐偉　錢國英　李彩燕

摘要：采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法，對姚江水系中華鱉（Pelodiscus sinensis）的6種組織（心臟、肝臟、脾臟、腎臟、肌肉、肺）中的乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）、谷氨酸脫氫酶（GDH） 3種同工酶進行了初步研究，并與日本品系中華鱉的同工酶譜圖進行了對比。結果表明：2個品系中華鱉的同工酶具有不同程度的組織特異性，LDH組織差異極為明顯；姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達量與日本中華鱉類似，EST-1表達量高于日本中華鱉，GDH整體表達量低于日本中華鱉，肌肉中GDH-3表達量高于日本中華鱉。本研究得到了姚江群體中華鱉的標志性酶譜，并明確了其與日本品系中華鱉酶譜的差異和特殊性。

關鍵詞：中華鱉；同工酶；表達；組織特異性；乳酸脫氫酶；酯酶；谷氨酸脫氫酶

中圖分類號： S917.4 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0244-03

中華鱉（Pelodiscus sinensis）又稱水魚、團魚、元魚、甲魚等，是我國重要的特種經濟動物和名特優水產養殖品種之一。近10余年來，在養鱉業蓬勃發展的同時，人們對野生資源的不合理開發加劇，中華鱉的生存形勢持續惡化，原種資源不斷減少。過度的食用消費、棲息地的破壞、化學污染等因素導致我國中華鱉種質資源遭受嚴重破壞，種群面臨大規模銳減、瀕臨滅絕的境地，尤其是一些特殊地域種群的原種地沒有引起足夠的重視。如主要分布在寧波姚江流域的姚江水系中華鱉原種已處于瀕危狀態，野生種質資源稀缺。該群體中華鱉抗病力強、適應性好、肉質鮮美、膠質濃郁，深受消費者喜愛。姚江水系中華鱉除了具有中華鱉的基本固有特征外，主要特征為腹部有4處明顯花斑，與其他品系中華鱉差異非常明顯。目前，關于中華鱉同工酶的研究大多集中于黃河群體、太湖群體和臺灣群體[1-3]，而姚江水系中華鱉同工酶表達差異的研究尚未見報道。為了有效保護中華鱉的種質資源，保持地方種群優良的種質性狀，應用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法對姚江水系中華鱉6種不同組織中的乳酸脫氫酶（LDH）、酯酶（EST）、谷氨酸脫氫酶（GDH） 3種同工酶進行了研究，并與日本品系中華鱉進行比較，以期在蛋白質水平上建立其種質資源的遺傳標記，為該地方品系中華鱉的種質鑒定、遺傳分析及良種選育提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為三齡雄性中華鱉，其中姚江水系中華鱉取自浙江省余姚市明鳳淡水養殖場，日本品系中華鱉取自紹興中亞工貿園有限公司。

1.2 樣品制備

活鱉運回實驗室后，迅速殺死取其心臟、肝臟、 腎臟、脾臟、肺和腿部肌肉，稱質量后加入Tris-HCl緩沖液（pH值 75）進行勻漿，再離心20 min，取其上清液與甘油按1 ∶2混合后，直接電泳或于-80 ℃保存備用。

1.3 電泳

采用聚丙烯酰胺垂直梯度凝膠電泳法[4-7]，操作步驟參考區又君等報道的方法[5]進行，電泳過程使用夾心式垂直板電泳槽（Mini-PROTEAN Tetra），取10 μL樣品加樣。分離膠濃度為7.5%（pH值8.8），濃縮膠濃度為4.5%（pH值6.8），電極緩沖系統為 Tris-Gly（pH值8.3），在160 V 恒壓、冰浴中電泳2 h（除EST研究的電泳時間為1.5 h外）。

電泳后的凝膠染色參照何忠效等[6]和郭堯軍[7]的操作方法，并加以修改（表1）。在電泳結束前，提前配制好染色液，其中EST染色液需過濾后使用。電泳后的凝膠置于染色液中直至顯色，LDH、EST檢測凝膠室溫下約染色20 min，GDH檢測凝膠置于37 ℃染色約4 h。經蒸餾水清洗染色后的顯色凝膠置于光亮背景下拍照記錄。

2 結果與分析

應用于種群生化遺傳分析的同工酶譜，除酶帶應清晰外，更重要的是反映出編碼該酶的幾個基因座位、存在幾個等位基因、是幾聚體的酶等特征性信息[8]。2個不同品系中華鱉的6種組織中3種同工酶活性強弱結果見表2。從表2中可以看出，2個品系中華鱉的心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH、EST 2種同工酶均明顯表達且含量較高，肺與肌肉中的LDH、EST、GDH 同工酶有所表達但相比于其他組織的同工酶含量則較少。其中姚江水系中華鱉的6種組織中屬肝臟組織中同工酶的整體表達量最高，而日本品系中華鱉的6種組織中屬腎臟組織中同工酶的整體表達量最高。

2.1 乳酸脫氫酶（LDH）

2個品系中華鱉6種組織的LDH同工酶的電泳圖譜如圖1所示。姚江水系中華鱉LDH同工酶在心臟、肝臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高，肌肉中LDH-1含量最高，肺中LDH-1、LDH-5的表達量均相對偏高，且在心臟、肝臟、腎臟、肌肉中有LDH-C基因（即LDH-6、LDH-7、LDH-8）表達。日本品系中華鱉LDH同工酶在心臟、脾臟、腎臟中LDH-5含量最高，肌肉中LDH-1含量最高，肺中LDH-1、LDH-5含量均相對偏高，且在心臟、肝臟、腎臟和肌肉中有LDH-C基因表達。姚江水系中華鱉相同組織LDH整體表達量與日本品系中華鱉類似，僅LDH-5在姚江水系中華鱉肝臟中表達高于日本中華鱉。

2.2 酯酶（EST）

中華鱉不同組織EST同工酶的電泳圖譜如圖2所示。由圖2可見，姚江水系中華鱉EST-1表達量高于日本品系中華鱉，日本品系中華鱉EST-4表達量遠高于姚江水系中華鱉，姚江水系中華鱉的腎臟組織中EST-3表達量大于日本品系中華鱉。姚江水系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達量都較高，EST-4表達量較低。姚江水系中華鱉的酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉，尤其是EST-2、EST-3在肝臟、腎臟有顯示清晰的酶帶，在脾臟有微弱的酶帶。日本品系中華鱉所有組織的EST-2、EST-3表達量都較高，EST-1、EST-4表達量相當，其酯酶總活性依次為肝臟>腎臟>心臟>脾臟>肺>肌肉，尤其是 EST-2、EST-3在肝臟、腎臟組織電泳有清晰的酶帶。

2.3 谷氨酸脫氫酶（GDH）

GDH為二聚體酶，在不同品系中華鱉的不同組織的GDH酶譜中均呈現了3個活性區域（圖3）。姚江水系中華鱉的肝臟、心臟、腎臟、肌肉組織中GDH表達量較高，其他組織表達量低，且在肌肉中有GDH-1、GDH-3的表達。日本品系中華鱉在肝臟、脾臟、腎臟、肌肉中GDH表達量均較高，其中肝臟中的GDH表達量最高；GDH-1在肌肉中大量表達而在其他組織幾乎不表達；肌肉中未檢測到GDH-2、GDH-3，而其他5種組織中都有所表達。日本鱉GDH表達量整體上高于姚江水系中華鱉，但肝臟和心臟組織中2個品系中華鱉的GDH表達量相近，肌肉組織中姚江水系中華鱉GDH-3的表達量高于日本中華鱉。

3 結論與討論

已有學者采用同工酶電泳分析了不同群體中華鱉的組織表達特異性[1-3，9-11]。如楊弘等采用垂直淀粉膠電泳對中華鱉腦、眼、心臟、肌肉、肝臟、腎臟和卵巢7種組織中的6種同工酶系統（LDH、ADH、IDH、ME、GAPDH、EST）進行研究，構建了中華鱉同工酶酶譜，揭示了LDH在中華鱉進化上的保守性[2]。姚雁鴻等運用垂直聚丙烯酰胺凝膠電泳技術對中華鱉和臺灣鱉的肝臟、腎臟、眼、肌肉等幾種組織中的LDH、EST同工酶進行比較研究，結果發現在中華鱉組織中有組織特異性、無多態性的LDH同工酶在臺灣鱉的組織中卻既有組織特異性又有多態性[3]。

3.1 乳酸脫氫酶

乳酸脫氫酶（LDH）是糖代謝途徑中一種重要的氧化還原酶，存在于機體所有組織細胞的胞質內，能催化丙酮酸與乳酸之間的相互轉化，是研究最廣泛的一種同工酶[1-3，9-12]。已經證明LDH同工酶系統具有明顯的種族及組織特異性[9，12]。心肌是含氧量豐富的組織，細胞以有氧代謝為主，催化乳酸生產丙酮酸的LDH-5占優勢。骨骼肌是相對缺氧的組織，催化丙酮酸還原生產乳酸的LDH-1占優勢，使骨骼肌因激烈運動造成的相對缺氧條件下仍能得以酵解獲得能量[13]。

中華鱉作為水陸兩棲的動物，能適應較大的含氧量波動，既能適應水環境，也能適應短時間的陸上生活，故其肺部LDH-1、LDH-5都有較多表達。肝臟、腎臟、脾臟中LDH-5占優勢的原因與心肌中LDH-5占優勢的原因類似，且不同組織其他的酶帶均有所差異，推測LDH可作為姚江水系中華鱉組織特異性鑒定的同工酶。

日本品系中華鱉和姚江品系中華鱉的心臟、肝臟、腎臟、肌肉組織都有LDH-C基因不同程度的表達，其表達量與相應組織在中華鱉體內的活動度有一定的線性關系，推測LDH-C基因的表達可增加產能。此外，在姚江水系中華鱉的肝臟中LDH-5占優勢，而在日本品系中華鱉中卻沒有出現該現象，這可能與日本中華鱉個體的脂肪含量較高有關（數據另文發表）。以上2個推測還有待進一步研究驗證。

3.2 酯酶

酯酶（EST）是催化酯類化合物水解進入中間代謝的重要水解酶，在細胞內執行最基本的生理功能[10]，其結構多為單體，由1個亞基組成[4]。EST還能水解大量正常存在的非生理性酯類化合物，可能與機體的解毒功能有關。本研究發現，姚江水系中華鱉EST整體表達量低于日本鱉，猜測原因可能與中華鱉的生存環境有關。

酯酶并非生理性修飾酶，故可以EST酶譜作為遺傳指標[14-15]。從酶譜整體的角度看，姚江水系中華鱉和日本品系中華鱉的EST酶譜均呈現組織特異性。 酯酶EST-4在日本品系中華鱉中表達而在姚江水系中華鱉中基本不表達，而姚江水系中華鱉腎臟中的酯酶EST-3表達量高于日本品系，且姚江水系中華鱉肝臟和腎臟中EST條帶數目多、活性強，具有種屬特異性，均可作為姚江水系中華鱉的種屬鑒定指標。

3.3 谷氨酸脫氫酶

谷氨酸脫氫酶（GDH）是動物體內參與谷氨酸新陳代謝的關鍵酶之一[12-15]，它以NAD、NADP或者同時利用兩者作為輔酶，參與到谷氨酸的合成與分解中，但在大多數生物體內反應是向著合成谷氨酸的方向進行的[16]。目前水產動物同工酶GDH的研究少見報道。本研究發現，GDH-3在日本品系中華鱉肌肉中不表達，而在姚江水系中表達，表明GDH-3的表達可能會導致某種生化途徑改變，從而影響生物的代謝途徑。由于谷氨酸是重要的鮮味氨基酸，故猜測GDH-3的高表達可能是姚江水系中華鱉與日本中華鱉相比味道更為鮮美的原因，但其相關性有待于進一步確認。GHD是氨基酸代謝中的重要酶類，尤其在非必需氨基酸的合成和轉化中起著重要作用[17]；因此GDH-3的表達是否直接影響氨基酸含量也有待于進一步研究。

參考文獻：

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