不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導及其次生代謝產物的影響

賈星遠

(河南中醫院第二附屬醫院，河南 鄭州 450000)

·中藥農業·

不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導及其次生代謝產物的影響

賈星遠*

(河南中醫院第二附屬醫院，河南 鄭州 450000)

目的：研究不同激素對冬凌草花瓣愈傷誘導及次生代謝產物含量的影響。方法：以冬凌草花瓣為外植體，在1/2 MS附加不同激素配比的培養基上誘導愈傷組織，HPLC法測定冬凌草甲素、乙素的含量，研究不同處理對愈傷組織誘導及次生代謝產物的影響。結果：當NAA的濃度過高時將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。在一定濃度范圍的6-BA可以促進冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成。1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1為冬凌草花瓣愈傷組織誘導最佳培養基。結論：不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導及冬凌草乙素的含量影響不同，為進一步研究冬凌草愈傷組織的培養提供了依據。

冬凌草；花瓣；愈傷組織；激素；甲素；乙素

冬凌草為唇形科香茶菜屬多年生草本或亞灌木植物碎米椏Rabdosiarubescens(Hemsl.)Hara.的干燥的上部分。碎米椏產于我國河南、山西、貴州、河北等地。具有清熱解毒、活血止痛等功效，同時對治療食管癌、結腸癌均有一定療效[1]。研究表明冬凌草中的主要抗癌、抗菌活性成分為二萜類化合物(冬凌草甲素、冬凌草乙素)[2]、迷迭香酸。

目前國內外關于冬凌草葉片愈傷組織的誘導及分化研究較多[3-5]，但對其花瓣組織誘導的研究未見報道。不同激素對愈傷組織的誘導及次生代謝產物含量有不同的作用，如不同激素對白及愈傷組織總酚含量的影響[6]中，2，4-D促進白及愈傷組織褐化。因此通過添加不同配比激素促進冬凌草花瓣愈傷組織的形成及其次生代謝產物合成，為冬凌草組織培養快繁體系的建立提供新的途徑。此外，植物愈傷組織的誘導是進一步研究再生植株的必要步驟以及建立植物細胞懸浮系的基礎，通過正交試驗法研究不同激素組合對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導及次生代謝產物合成的影響，為冬凌草細胞懸浮培養材料的篩選奠定基礎。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗材料

實驗材料為實驗室內冬凌草無菌苗花瓣。

1.2 實驗方法

1.2.1 不同配比激素條件下冬凌草花瓣愈傷組織的誘導 將冬凌草無菌苗花瓣剪成0.2 cm×0.2 cm大小塊狀，分別接種于1/2 MS加不同激素配比的培養基中(如表1所示)，在光照12 h·d-1、(25±1) ℃、無菌條件下培養。第20 d統計誘導率，褐化率。

表1 不同激素配比 /mg·L-1

1.2.2 冬凌草有效成分含量的測定 第20 d，取出不同激素配比條件下得到的愈傷組織，稱重后放置于烘箱中，80 ℃烘至恒重，用研缽研成粉末，備用。采用HPLC法，測定冬凌草甲素、乙素含量(干重含量)，具體提取、測定方法如下。

1.2.2.1 供試品溶液的制備 精密稱取0.10 g的冬凌草愈傷組織粉末，置于100 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL的甲醇，稱重，靜置30 min，超聲30 min后放置室溫，補足重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得，作為供試樣品測定冬凌草甲素含量[7]，每個樣品重復3次。精密稱取0.10 g的冬凌草愈傷組織粉末，置于100 mL的具塞三角瓶中，加入30 mL的丙酮，稱重，靜置30 min，水浴回流90 min后放置室溫，補足重量；搖勻，過濾，吸取過濾液20 mL，水浴蒸干，用甲醇定容于10 mL容量瓶中；搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得，作為供試樣品測定冬凌草乙素的含量[8]，每個樣品重復3次。

1.2.2.2 色譜條件的選擇 Waters e2695，Waters 2489紫外檢測器；色譜柱為Agilent XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；冬凌草甲素流動相∶甲醇-水(55∶45)，冬凌草乙素流動相∶甲醇-0.5%磷酸水溶液(51∶49)；檢測波長為238 nm，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30 ℃。

2 結果與分析

2.1 不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織誘導的影響

冬凌草花瓣接種于不同激素組合的培養基上，第三天花瓣向上卷曲并開始長大，隨著培養時間延長花瓣越長越大，第七天的部分花瓣變成透明狀態，第十二天部分愈傷組織開始形成，第十七天不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷出現褐化現象，但不同激素組合對冬凌草花瓣愈傷組織的誘導及褐化作用不同(見表2)。

表2 不同激素配比對冬凌草愈傷組織誘導及次生代謝產物的影響

由表2可以得出不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織的誘導率差異性不顯著，將花瓣接種到上述9種培養基中后，冬凌草花瓣愈傷組織的誘導率在60%-100%之間，6號誘導率為60.00%，相對較低，其中4、5、9號誘導率最高為100.00%。其他誘導率在75%-90%之間。但是不同激素配比條件下所誘導的冬凌草愈傷組織褐化現象差異顯著。上述結果表明不同激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草甲素含量為0 mg·g-1。

通過SPSS分析軟件對上述結果進行相關性分析結果如表3。

表3 不同激素對冬凌草花瓣愈傷誘導及次生代謝產物影響的相關性分析

注：表中*表示顯著相關，P<0.05。

由表3可以得出冬凌草花瓣愈傷組織的誘導與6-BA、2，4-D成正相關，與NAA成負相關，但是相關性不顯著。NAA與冬凌草花瓣愈傷組織的褐化成顯著的負相關，相關系數為-0.788(P<0.05)，上述結果表明NAA是冬凌草花瓣愈傷組織誘導較為重要的一種激素，當NAA的濃度過高時將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。6-BA與冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成成正相關相關系數為0.684*(P<0.05)，隨著6-BA濃度增加愈傷組織中冬凌草乙素的含量相對提高，當其濃度為2 mg·L-1時濃度達到最高，若再增加6-BA 的濃度愈傷組織中冬凌草乙素的變化有待進一步研究。

3 討論與結論

本實驗應用組織培養的方法研究了不同激素對冬凌草花瓣愈傷組織誘導的影響，實驗結果表明NAA是冬凌草花瓣愈傷組織誘導較為重要的一種激素，當NAA的濃度過高時將會引起冬凌草花瓣愈傷組織的褐化。6-BA可以在一定濃度范圍內促進冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的生物合成，但其濃度超過2 mg·L-1以后，若再增加6-BA冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草乙素的變化有待進一步研究。上述結果中9號激素條件下冬凌草花瓣愈傷組織誘導率為100.00%，褐化率為0.00%，且冬凌草乙素含量相對較高，綜合考慮將9號激素條件作為冬凌草花瓣愈傷組織誘導的最佳條件選擇。9種激素配比條件下冬凌草花瓣愈傷組織中冬凌草甲素的含量均為0 mg·L-1。故不同激素均不能刺激冬凌草甲素的生物合成。與冬凌草組織培養中主要次生代謝產物積累動態的研究結果相同[9]，培養過程中隨著細胞脫分化的進行冬凌草甲素含量逐漸降低，在細胞分化初期、芽分化初期含量為零，隨著植物器官的再生，冬凌草甲素含量逐漸上升，這說明冬凌草甲素的生物合成可能與冬凌草植株內特定的組織或器官有關，而愈傷組織細胞往往缺少特定組織或器官，使得其次生代謝產物一冬凌草甲素的合成不能夠進行。冬凌草植株再生過程中冬凌草甲素積累機制的研究表明[10]，冬凌草培養物內葉綠素、丙酮酸的含量、可溶性蛋白與冬凌草甲素積累有相互促進的關系，冬凌草內主要次生代謝產物冬凌草甲素為二萜類化合物，該代謝產物的形成是以光合產物為基礎，冬凌草愈傷時期不能進行光合作用故冬凌草甲素的生物合成受到限制。大量研究表明，萜類物質生物合成在植物發育過程中由于控制時間和地點的不同使這一過程的調控變得較為復雜，總的來說可分為空間調控和階段調控[11]。階段調控主要指萜類化合物的產生與植物的發育過程有密切的相關性。如藥用植物青蒿中有效成分青蒿素的形成、積累及分布不僅具有較強的組織特異性，而且與植株的生長發育(尤其是開花)存在著一定的相關性。辣椒中的辣椒素只有在生殖生長的后期才能在果皮中合成并積累[12]。本實驗為進一步研究研究冬凌草愈傷組織的培養提供了依據。

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EffectsofDifferentPhytohormoneonCallusTissueInductionofRabdosiarubescens(Hemsl.)HaraPetalandtheAccumulationofMainSecondaryMetabolites

JIAXingyuan*

(HenanProvinceHospitalofTraditionalChineseMedicine，Zhengzhou450000，China)

Objective：To study the effects of different phytohormone on callus tissue induction ofRabdosiarubescenspetal and the accumulated of main secondary metabolites.Methods：WithR.rubescenspetals as explant，the callus was induced on 1/2 MS medium with different phytohormone combination.HPLC method was used for the determination of oridonin，ponicidin content.The effects of different treatments on callus tissue induction and the accumulated of main secondary metabolites were studied.Results：NAA is an important phytohormone，high concentrated NAA easily led to callus browning.6-BA can promote the synthesis of ponicidin of callus tissue in the certain concentration range.The best medium of inducing callus was 1/2 MS+6-BA 2.0 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1.Conclusion：Each phytohormone had different efferent on callus tissue induction and the accumulated of ponicidin.The research provides reference for further studies on the callus tissue culture ofR.rubescens.

Rabdosiarubescens；petal；callus tissue；phytohormone；oridonin；ponicidin

2014-12-19)

*

賈星遠，初級中藥師，研究方向：中藥質量控制與配伍研究；E-mail:745672523@qq.com

10.13313/j.issn.1673-4890.2015.4.017