高產林可霉素鏈霉菌的篩選及發酵條件的優化

高產林可霉素鏈霉菌的篩選及發酵條件的優化

鄧加聰1，施瀟蕊1，曾德樣1，張文森2，徐慧詮2，唐慧華2，鄭虹1*
（1.福建師范大學福清分校海洋與生化工程學院，福建福清350300；2.福建師范大學福清分校朗姆多果酒研究所，福建福清350300）

采用平板劃線，搖瓶復篩等方法從福清近海海域泥土中分離篩選到一株林可霉素產率較高的鏈霉菌株6204；采用單因素試驗和正交設計試驗，從葡萄糖添加量、磷酸二氫鉀條件兩及金屬離子對菌株6204產林可霉素影響，并對其發酵條件進行優化。結果表明，最適的發酵條件為葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀添加量0.020%，在此優化發酵條件下，菌株6204產林可霉素的含量可達3 907.738 μg/mL，與優化前相比較，林可霉素的含量提高了1 823.082 μg/mL。

鏈霉菌；選育；林可霉素；發酵條件；優化

林可霉素是林肯鏈霉菌（Streptomyces lincolnensis）發酵產生的一類抗生素，對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）等革蘭氏陽性菌具有較強的拮抗作用。在醫藥方面，主要用于呼吸道、皮膚及軟組織感染等疾病的治療，由于其療效穩定、不良反應小、使用安全，作為青霉素的替代藥逐漸被應用于臨床中［1］。

目前對于產林可鏈霉菌的研究，國內研究主要集中于菌種選育［2-4］、培養基優化［5-6］，或采用基因工程的方法對產林可菌株進行工程菌的改造［7-10］，以期提高菌株產林可的產量。在菌種選育方面，孟娜等［2］采用硫酸二乙酯和紫外復合誘變方法，得到一株遺傳性能良好的突變株，其林可霉素效價可達到4 082 U/mL，比出發菌株提高了107%；李靜仁［3］以林可霉素產生菌L92為出發菌株，采用氯化鋅、紫外線和硫酸二乙酯三重誘變，獲得高產菌株L-96，其搖瓶效價較出發菌株提高了50.2%。在培養基優化方面，薛正蓮等［5］采用響應面法對鏈霉菌SL-98-2-8的發酵培養基進行優化，得到最佳的發酵條件為淀粉2.1%，玉米漿0.33%，葡萄糖8.5%，豆餅粉2.53%，磷酸二氫鉀0.022%，在此條件下，林可霉素的含量為3 700 μg/mL，比優化前提高了12%；鐘益清［6］通過罐上工藝改進對林可霉素發酵進行研究，使林可霉素的生物效價從無補料的3 851 μg/mL提高到7 421 μg/mL。陳林［7］以鏈霉菌N9為出發菌，增加林可霉素的甲基化基因orf25、orf12，調控基因orf22或整個生物合成基因簇IE8拷貝數的遺傳改造，林可霉素A產量分別提高5.52%、13.75%、6.24%、17.3%。薛正蓮等［8］用紫外線和激光對林肯鏈霉菌原生質體進行復合誘變，得到一株林可霉素高產菌株SL98-2-8-116，其搖瓶效價可達3 629 μg/mL，較出發菌株提高了18.3%。國外學者研究主要在于林可霉素的合成途徑，KAMENIK Z等［11］用高效液相色譜對林可霉素發酵過程的中間體進行檢測，進而推知跟林可霉素合成有關的關鍵步驟和中間體，對其進行改進，提高林可霉素的產量。

本研究從福清近海海域泥土中，分離篩選出一株林可霉素產量較高的菌株鏈霉菌6204，并采用單因素試驗及正交試驗對其發酵條件進行優化研究，得到該菌株產林可霉素的最適發酵條件，提高鏈霉菌6204林可霉素的產量，為林可霉素的后期純化和研究應用提供一定的基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1實驗菌株

鏈霉菌（Streptomyces）：分離于福清近海海域泥土。

1.1.2化學試劑

玉米漿粉、黃豆餅粉：市售；林可霉素注射液（2 mL/0.6 g）：購自福清永惠醫藥超市；可溶性淀粉、葡萄糖、硫酸氫二鉀、硝酸鉀、硫酸鎂、氯化鈉等試劑（均為分析純）：國藥集團藥業股份有限公司。

1.1.3培養基

平板培養基/斜面培養基：可溶性淀粉20 g/L，KNO31 g/L，K2HPO4·3H2O 0.5 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，NaCl 0.5g/L，黃豆餅粉5g/L，FeSO4·7H2O0.01g/L，瓊脂粉18g/L，pH 7.2～7.3，121℃滅菌15 min。

種子培養基：葡萄糖15 g/L，可溶性淀粉20 g/L，玉米漿粉16 g/L，黃豆餅粉15 g/L，（NH4）2SO41.6 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

基礎發酵培養基：葡萄糖100 g/L，玉米漿粉1 g/L，黃豆餅粉26 g/L，（NH4）2SO48 g/L，KH2PO40.2 g/L，NaCl 5 g/L，NaNO38 g/L，CaCO38 g/L，pH 7.0，121℃滅菌15 min。

1.2儀器與設備

NRY2102C恒溫振蕩器：上海南榮實驗室設備有限公司；LDZX-50BI立式自動電熱壓力蒸氣滅菌器：上海申安醫療器械有限公司；SPX-150B-2生化培養箱：南京艾賽特科技有限公司；SW-CJ-IFD超凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；THZ-C臺式恒溫振蕩器：太倉市華美生化儀器廠；DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱：上海精宏實驗設備有限公司；H1850R高速臺式冷凍離心機：湖南湘儀離心機儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1鏈霉菌牛奶凍干管的稀釋涂布

稱取1 g近海海泥，加入100 mL無菌蒸餾水，靜置30 min，充分混勻后，用無菌蒸餾水稀釋至梯度為10-2、10-3、10-4，充分混勻后，取0.2 mL稀釋液涂布于平板培養基，30℃倒置培養15～20 d，挑取顏色白、菌落大的單菌落，接種于試管斜面，培養后，4℃冰箱保存備用。

1.3.2林可霉素高產菌株的篩選

將挑取到的單菌落接種于試管斜面活化；接種于裝有100 mL種子培養基的250 mL三角瓶中，30℃、150 r/min振蕩培養72 h；按10%接種量將種子液接種于裝液量為100 mL/250 mL發酵培養基中，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，發酵液4℃、8 000 r/min離心5 min，測定上清液中林可霉素的含量并計算其相對效價。

1.3.3鏈霉菌6204的活化及種子液的制備

4℃保存的鏈霉菌6204接種于試管斜面活化；接種于種子培養基，30℃、150 r/min振蕩培養72 h。

1.3.4單因素試驗

（1）葡萄糖添加量對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

改變基礎發酵培養基中葡萄糖的含量，葡萄糖添加量分別為2.5%、5.0%、7.5%、10.0%、12.5%，30℃、150 r/min振蕩培養96h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。

（2）金屬離子對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

在基礎發酵培養基中分別添加0.20g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。

（3）磷酸二氫鉀添加量對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

在基礎發酵培養基中添加不同含量（0.005%、0.010%、0.015%、0.020%、0.025%、0.030%）的磷酸二氫鉀，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。

1.3.5發酵條件優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以林可霉素含量作為評價指標，采用3因素3水平設計正交試驗，其因素與水平見表1。

表1　發酵條件優化正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

1.3.6林可霉素含量的測定

采用紫外分光光度法［12-13］測定溶液中林可霉素的含量。林可霉素的含量及相對效價計算公式如下：

2　結果與分析

2.1牛奶凍干管的稀釋涂布

將鏈霉菌牛奶凍干管進行稀釋涂布，從分離平板上篩選出17株菌落大且顏色白的單菌落，接種于試管斜面，菌株編號為：6101、6102、6201、6202、6203、6204、6205、6301、6302、6303、6304、6305、6401、6402、6403、6404、6405。

2.2高產林可霉素鏈霉菌菌株的篩選

將挑取到的單菌落接種于發酵培養基，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液的林可霉素含量并計算其相對效價。結果見圖1。

圖1　不同菌株產林可霉素的影響Fig.1 Effect of different strains on lincomycin production

由圖1可知，不同菌株產林可霉素效價各不相同，其中林可霉素含量最高的菌株是鏈霉菌6204，該菌株發酵液中林可霉素的含量達2 773.07 μg/mL，相對效價為100%。因此，選用鏈霉菌6204進行下列的發酵試驗。

2.3單因素試驗結果

2.3.1葡萄糖添加量對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

改變基礎發酵培養基中葡萄糖的添加量，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。結果見圖2。

圖2　葡萄糖添加量對菌株產林可霉素的影響Fig.2 Effect of glucose addition on lincomycin production

由圖2可知，菌株林可霉素的含量隨著葡萄糖添加量的增加呈先增后降的趨勢，當葡萄糖添加量為7.5%時，發酵液中林可霉素的含量達到最大，為2 481.48 μg/mL，相對效價119.04%。葡萄糖的添加量過低會影響菌體的生長，而過高又會出現葡萄糖效應，進而影響林可霉素的生產合成。因此，基礎發酵培養基中葡萄糖的最適添加量為7.5%。

2.3.2金屬離子對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

在基礎發酵培養基中加入0.20 g/L的ZnSO4、MgSO4、FeSO4、Fe2（SO4）3、MnSO4、CuSO4，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。結果見圖3。

圖3　不同的金屬離子對菌株產林可霉素的影響Fig.3 Effect of different metal ion on lincomycin production

據文獻報道［14-15］，發酵培養基中添加一定量的金屬離子，對菌株產林可霉素具有一定的影響。由圖3可知，金屬離子對菌株產林可霉素的影響順序如下：Mg2+＞Cu2+＞Fe3+＞Zn2+＞Fe2+＞Mn2+，不添加任何金屬離子的對照（CK）組對比，添加有Mg2+、Fe3+、Cu2+的發酵培養基中，林可霉素的相對效價均＞100%，其中添加有Mg2+的發酵培養基中，菌株6204產林可霉素的量可達2 471.56 μg/mL，相對效價為118.56%。與CK相比，林可霉素的產量提高了18.56%。因此，基礎發酵培養基中最適添加0.20 g/L金屬離子Mg2+。

2.3.3磷酸二氫鉀添加量對鏈霉菌6204產林可霉素的影響

在基礎發酵培養基中加入不同含量的磷酸二氫鉀，30℃、150 r/min振蕩培養96 h，測定發酵液中林可霉素的含量并計算其相對效價。結果見圖4。

圖4　磷酸二氫鉀含量對菌株產林可霉素的影響Fig.4 Effect of KH2PO4addition on lincomycin production

據文獻報道［17］，一定含量的磷酸鹽會影響菌株林可霉素的合成。由圖4可知，林可霉素的含量隨著磷酸二氫鉀添加量的升高呈先增后降的趨勢，當磷酸二氫鉀的添加量為0.01%時，發酵液中林可霉素的含量達到最大值，為2 742.725 μg/mL，相對效價達到131.57%?？赡苁怯捎谠诟邼舛攘姿猁}的環境下，有利于微生物蛋白質的合成，進而延長了菌株的生長期，但由于后期營養不足，使得林可霉素的合成受到影響。因此，基礎發酵培養基中磷酸二氫鉀的最適添加量為0.01%。

2.4發酵工藝優化正交試驗

根據單因素試驗結果，以林可霉素含量作為評價指標，進行3因素3水平正交試驗，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　發酵條件優化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation conditions optimization

表3　正交試驗結果的方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2可知，3個因素對林可霉素含量的影響大小分別為磷酸二氫鉀添加量＞葡萄糖添加量＞鎂離子質量濃度。菌株6204產林可霉素的最佳配比組合為A3B1C3，即葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀添加量0.020%，在此最佳發酵條件下，菌株6204產林可霉素的量可達3 907.738 μg/mL。

由表3可知，磷酸二氫鉀添加量對菌株6204產林可霉素有著極顯著（P＜0.01）影響，葡萄糖添加量對菌株6204產林可霉素有著顯著（P＜0.05）影響，而鎂離子質量濃度對菌株6204產林可霉素影響不顯著（P＞0.05）。

3　結論

從福清海域泥土中分離篩選到一株產林可霉素較高的菌株6204，根據單因素試驗和正交試驗，研究葡萄糖添加量、磷酸二氫鉀添加量及金屬離子質量濃度對菌株6204產林可霉素的影響，并對其發酵條件進行優化，得到菌株6204產林可霉素的最佳發酵條件，即葡萄糖添加量10.0%，鎂離子質量濃度0.10 g/L，磷酸二氫鉀含量0.020%，在此最佳發酵條件下，林可霉素的含量可達3 907.738 μg/mL。

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Screening ofStreptomycessp.with high-yield lincomycin and its fermentation condition optimization

DENG Jiacong1，SHI Xiaorui1，ZENG Deyang1，ZHANG Wensen2，XU Huiquan2，TANG Huihua2，ZHENG Hong1*
（1.School of Ocean and Biochemical Engineering，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300，China；2.Reseach Institute of Rum Wine，Fuqing Branch of Fujian Normal University，Fuqing 350300，China）

Abastract：Strain 6204 with high-yield lincomycin was isolated and screened from soil of coastal waters by plate streaking and shaking flask.And the fermentation conditions of strain 6204 were studied and optimized by single factor and orthogonal experiment，using glucose addition，potassium dihydrogen phosphate concentration and metal ions as evaluation factors.The results showed that the optimum fermentation conditions were glucose 10.0%，magnesium ion 0.10 g/L，potassium dihydrogen phosphate 0.020%.Under the conditions，the lincomycin concentration produced by strain 6204 could up to 3 907.738 μg/ml，which improved 1 823.082 μg/ml than that before optimization.

Streptomycessp.；screening；lincomycin；fermentation conditions；optimization

TQ925

A

0254-5071（2015）11-0099-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2015.11.023

2015-10-15

福建省自然科學基金項目（2015J01132）；福建省教育廳中青年教師項目（JA15569）；福建省中青年教師教育科研項目（JA11285）；福建省科技計劃引導性項目（2015N0004）；福建省大學生創新創業基金項目（20422337）

鄧加聰（1981-），男，副教授，博士研究生，研究方向為微生物菌株篩選及發酵。

鄭虹（1981-），女，實驗師，碩士，研究方向為微生物菌株篩選及發酵。