1-(4-溴苯基)-5-苯基-1H-1,2,3-三氮唑鍵合人血清白蛋白的作用機制及抗菌活性

張 寧, 岳玉林, 吳秀麗， 吳祿勇, 莫崢嶸, 司宏宗, 舒火明, 何文英*

(1.海南師范大學化學化工學院，海南?？?571158；2.青島大學計算科學與工程技術研究中心，山東青島 266071；3.海南經貿職業技術學院，海南?？?571127)

圖1 BPTA的化學結構式Fig.1 The structure of BPTA

1,2,3-三氮唑化合物具有廣泛的生理活性,它易與生物體內多種酶和受體結合,已經被用于多肽、DNA、RNA和糖類等化合物結構修飾中,并表現出良好的效果，在醫藥領域發揮越來越重要的作用而成為目前新藥研發的重點領域之一[1，2]。1-(4-溴苯基)-5-苯基-1H-1,2,3-三唑(1-(4-bromophenyl)-5-phenyl-1H-1,2,3-triazole,BPTA)(結構見圖1)是新合成的一種三氮唑類化合物[3]，作為一種潛在開發利用的藥物小分子，系統研究它的抗菌活性及其與人體內生物大分子的相互作用還未見報道。血清白蛋白由于在哺乳動物體內起著重要的貯存和運輸作用,也是藥物的一種非常重要的運輸載體，故常用作研究與藥物小分子相互作用的模型蛋白[4,5]。

本文在模擬生理條件下結合分子模擬、熒光偏振、同步及三維熒光等方法研究了BPTA與人血清白蛋白(HSA)的相互作用，確定了鍵合參數及作用力模式，定性分析了BPTA對HSA二級結構及微環境的影響。通過研究BPTA與HSA的相互作用及抗菌活性,不僅揭示了BPTA生物活性的新信息，而且對于設計BPTA類新藥，篩選相關藥物等都具有非常重要的指導意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

F-7000型熒光光度計(日本，日立公司)；RF-5301PC型熒光光度計(日本，島津公司)；TU-1901型雙光束紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；BS124S電子天平(德國，賽多利斯)；pH-3S酸度計(上海精密儀器廠)。

BPTA(海南師范大學有機化學重點實驗室提供,純度>99.9%，分子量為301)儲備液濃度1.70×10-3mol·L-1，用甲醇配制。三羥甲基氨基甲烷(Tris，國藥集團化學試劑有限公司)-HCl緩沖溶液:用超純水溶解并用HCl調節pH至7.40,配制成濃度為0.05 mol·L-1的緩沖溶液。人血清白蛋白(HSA，上海伯奧生物科技有限公司)溶液用pH=7.40 Tris-HCl 緩沖溶液配制，儲備液濃度3.0×10-5mol·L-1，于 4 ℃暗處保存。其他試劑均為分析純。實驗用水為超純水。

1.2 實驗方法

1.2.1BPTA的結構優化及與HSA的分子模擬利用SYBYL7.3軟件獲得化合物的三維結構,再根據Tripos力場對各種最合理分子的起始構象進行能量優化，以能量最低者(生成熱)為藥效構象；用共軛梯度法進一步優化BPTA分子結構。分子模擬步驟為：先從Brookhaven蛋白質數據庫中獲得HSA的晶體結構(編號為1h9z),根據Tripos力場，用kollman-all-atom電荷計算出HSA三維結構的勢能；再用Surflex程序來確定BPTA與HSA分子之間的相互作用模式[6]。

1.2.2熒光偏振度及同步熒光的測定實驗選擇激發與發射狹縫寬度均為5 nm,依據文獻方法[7]，以激發波長280 nm,發射波長348 nm測定熒光偏振;以230 nm為激發波長，290 nm為發射波長測定同步熒光(△λ=60 nm)。

1.2.3三維熒光光譜實驗選擇擇激發和發射狹縫寬度均為5 nm，分別測定激發波長在230～325 nm范圍，發射波長在230～480 nm范圍的三維熒光光譜。

1.2.4紫外吸收光譜依次移取一定量的HSA和BPTA儲備液于10 mL比色管中，用pH=7.40的Tris-HCl 緩沖溶液定容，以試劑空白為參比,掃描HSA-BPTA體系在200～350 nm范圍內的紫外吸收光譜。

1.2.5鍵合參數及熱力學參數的測定實驗選擇激發/發射波長為280/348 nm，采用熒光滴定法,分別測定溫度299 K、309 K和319 K下BPTA-HSA體系的熒光強度,再依據相應的公式[8]計算結合常數。

1.2.6位點標記的競爭實驗采用熒光滴定法，向BPTA-HSA體系分別加入一定量的Phenylbutazone (PB)、Flufenamic(FA)和Digitoxin(Dig)，分別作為位點Ⅰ、位點Ⅱ、位點Ⅲ的標記藥物[9]。選擇激發/發射波長為280/348 nm，測定HSA-BPTA體系在溫度298 K的熒光強度。

1.2.7抗菌活性測定選取大腸桿菌、白色葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、四聯球菌、藤黃八疊球菌及白色念珠菌作為實驗菌，以環丙沙星藥物做對照，用微量稀釋法進行抗菌藥物的初步篩選[10]。

2 結果與討論

2.1 BPTA分子的優化結構及光學活性

圖2 BPTA的優化結構Fig.2 The optimized structure of BPTA

圖2為優化的BPTA分子的三維結構,計算得到其最高占有軌道能量(HOMO)為-8.9604 eV，最低未占分子軌道能量(LUMO)為-4.1663 eV。

圖3為常溫下BPTA在甲醇中的熒光光譜，圖中曲線a為激發波長為296 nm時，BPTA的熒光發射光譜，顯示最大發射峰位置在366 nm處；而曲線b為發射波長為366 nm時，BPTA的激發光譜。表明濃度在10-3mol·L-1數量級條件下，BPTA有較強的熒光強度，這是由于BPTA分子中存在部分的共軛π鍵結構，也存在N的給電子取代基的原因[11]。

圖4為BPTA在Tris-HCl緩沖溶液中的紫外-可見光譜,呈現明顯的雙峰,其最大吸收波長位于206 nm,應是苯環的E2特征吸收帶(204 nm)發生的紅移,一是溴原子作為助色團的存在,二是溶劑效應,Tris-HCl緩沖液是水溶液體系。另在245 nm 處有一肩峰,推斷是BPTA分子中部分共軛骨架的π-π*躍遷導致的K吸收帶[12]。通過制作標準曲線,獲得BPTA在Tris-HCl緩沖液中的摩爾吸光系數ε為3.365×104L·mol-1·cm-1。

圖3 BPTA在甲醇中的熒光發射光譜及激發光譜Fig.3 Fluorescence spectra of BPTA in methanol a：emission spectra;b：excitation spectra.cBPTA=1.3×10-3 mol·L-1.

圖4 BPTA在Tris-HCl緩沖溶液中的紫外-可見光譜Fig.4 UV-Vis spectra of BPTA in Tris-HCl buffer a-i:cBPTA:3.33,6.67,10,13.33,16.67,20,23.33,26.67,30 (×10-6 mol·L-1);T=298 K.

以上結果表明BPTA分子不僅有較大的空間位阻,也具有良好的光譜特征,可為今后研發BPTA作為新型藥物的設計及分析其含量提供科學合理的依據。

圖5 BPTA與HSA的模型對接圖(HSA的氨基酸殘基用飄帶狀表示，BPTA用棍狀表示)Fig.5 The binding mode between BPTA and HSA,only residues around 8 ? of BPTA is displayed The residues of HSA are represented using ribbon model and the BPTA structure is represented using ball and stick model.

2.2 BPTA與HSA作用的結合位點確定

圖5為BPTA鍵合HSA的分子模擬圖?？煽闯?，HSA分子有合適的空間容納BPTA分子,而BPTA分子也可以鍵合在HSA分子的疏水腔內，整個分子呈非平面結構，且很靠近HSA分子的苯丙氨酸(Phe)134和酪氨酸(Tyr)160，這不僅是BPTA與HSA的鍵合存在疏水作用的一個有力證據，也表明BPTA能猝滅HSA的內源熒光，與后面的有關熒光光譜法的測定結果一致。另外，還顯示出BPTA與HSA氨基酸殘基的精氨酸(Arg)117位(距離:2.029 ? 和2.509 ?)及(Arg)186(距離:2.271 ?) 位可形成三個氫鍵,這就使得體系的親水性降低,疏水性增大。這些結果均說明BPTA鍵合HSA的反應是自發進行的，作用力的模式主要是疏水作用，兼有氫鍵作用。

為確定BPTA與HSA作用的結合位點，選擇對HSA具有特異結合性的三種競爭試劑Phenylbutazone (PB)、Flufenamic(FA)和Digitoxin(Dig)分別作為空間區域位點Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 的標記藥物[13]。結果表明,與不加競爭試劑時的結合常數K值和結合位點數n值相比,均發生較大程度的變化。其中加入FA標記藥物時，K值和n值的變化最明顯，說明BPTA與HSA的結合在位點Ⅱ,但結合位點數卻很小,進一步說明FA是HSA高選擇性的位點Ⅱ標記物，隨FA的加入,與BPTA競爭位點Ⅱ,使得BPTA的結合位點數減少。

2.3 BPTA與HSA作用的光譜表征

通過改變BPTA的濃度測定HSA的熒光偏振值。結果顯示，在不同溫度(309 K與319 K)下,隨BPTA濃度的增大(0～40.00×10-6mol·L-1)，熒光偏振值的變化不明顯，且數值都較小(均小于0.05)。說明溫度對熒光偏振值的影響不大；較小的偏振值暗示BPTA與HSA結合得松，結合后的大分子弛豫時間短，使HSA在從螺旋到無規卷曲伸展變化時，由于撓性增大，故熒光偏振就小[14]。

在蛋白質分子中,同步熒光(△λ=60 nm)呈現的是Trp殘基的光譜特征[13]。圖6為BPTA-HSA體系的同步熒光光譜圖?？梢钥闯觯築PTA的存在猝滅了HSA的Trp殘基熒光,熒光強度從115降至90左右,其最大熒光發射峰位置基本未變,說明BPTA對HSA微環境有一定影響。

蛋白質的約210 nm處的峰是肽鍵的強吸收峰，其最大吸收峰反映其α-螺旋結構的信息[15]。圖7為HSA、BPTA及BPTA-HSA體系的紫外光譜圖?？煽闯鯤SA最大吸收波長位于206 nm左右,隨BPTA濃度的增加,HSA-BPTA體系的吸收強度相應增加,雖最大吸收波長的位置未發生變化,但峰形與BPTA的吸收峰形有明顯差異(圖4)。以上結果說明:BPTA確實與HSA發生了相互作用,使得HSA的α-螺旋結構發生一定變化。

圖6 BPTA-HSA體系的同步熒光光譜圖(△λ=60 nm)Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of BPTA-HSA system(△λ=60 nm) a:cHSA=3.0×10-6 mol·L-1;b-g:cBPTA:6.67,13.33，20.00，26.67，33.33，40.00(×10-6 mol·L-1).

圖7 BPTA-HSA體系的紫外(UV)光譜圖Fig.7 UV spectra of BPTA-HSA systems cHSA=2.0×10-6 mol·L-1;a-f:cBPTA:0,2.67,5.33,8.00,10.67,13.33(×10-6 mol·L-1);T=298 K.

圖8為HSA-BPTA體系的三維熒光光譜?？煽闯?，兩種熒光光譜圖的峰形均呈現規則形狀；隨BPTA濃度的加大，BPTA猝滅了HSA的內源色氨酸殘基的熒光,且最大發射波長從350 nm紅移至360 nm。一是由于BPTA的分子結構中存在的三氮唑環上的N原子為給電子基團，導致熒光光譜產生位移，及吸收光強度的增大(圖7)；二是加入BPTA后，使得HSA的微環境極性增大，從而形成規則的發射光譜[8]。以上均說明BPTA的存在對HSA的色氨酸殘基所處的微環境引起的差異,也表明了HSA分子中構象的變化。

圖8 (A) HSA的三維(3D)熒光光譜圖(cHSA=3.0×10-6mol·L-1);(B) BPTA-HSA體系的三維(3D)熒光光譜圖(cBPTA=4.0×10-5mol·L-1) Fig.8 (A) The 3D fluorescence spectra of HSA(cHSA=3.0×10-6mol·L-1);(B) The 3D fluorescence spectra of BPTA-HSA system(cBPTA=4.0×10-5 mol·L-1)

2.4 BPTA對HSA作用的熒光猝滅機理

在模擬生理條件(pH=7.40 的Tris-HCl緩沖液)下，選取三個不同溫度(299 K、309 K及319 K)進行熒光滴定的測定，獲得Stern-Volmer圖(略)及KSV值(表1)，猝滅曲線的斜率即猝滅常數KSV值均為103數量級，猝滅速率常數均大于2.0×1010L·mol-1·s-1，且隨溫度的增大而減小，再結合吸收光譜(圖7)，表明BPTA對HSA的熒光猝滅機理為靜態猝滅[13]。

表1 不同溫度下BPTA-HSA的鍵和常數及熱力學常數

2.5 BPTA與HSA的鍵合參數及模式確定

圖9 BPTA-HSA體系的Stern-Volmer圖Fig.9 The Stern-Volmer plot for BPTA-HSA systems cHSA=3.0×10-6 mol·L-1.pH=7.40;λex=280 nm,λem=348 nm.

在不同溫度下進行熒光滴定實驗，依據修飾的Stern-Volmer公式求得鍵合常數及鍵合位點數[13,16]，見表1及圖9，可看出BPTA與HSA的鍵合常數K值(104數量級)都較大，且隨溫度的增大，K值呈增大趨勢，而鍵合位點數n呈減小趨勢。說明BPTA對HSA的鍵合作用較強，且溫度的變化會影響鍵合常數的大小。

利用Van’t Hoff方程，根據不同溫度下KSV的值可求得BPTA與HSA作用的熱力學常數(表1)，△G值表明BPTA與HSA的鍵合過程是自發進行的;△H值及△S值表明氫鍵和范德華力為主要的鍵合模式。綜合分子模擬與熱力學計算的結果，得出：BPTA主要以疏水作用、氫鍵及范德華力鍵合HSA。

根據F?rster 非輻射能量轉移理論[13],將HSA看做能量轉移給體，BPTA為能量轉移受體，測定HSA的熒光光譜與BPTA的吸收光譜重疊圖(圖略)，求得光譜重疊部分的積分值為2.424×10-14cm3·L·mol-1，臨界距離R0為4.02 nm，r值為6.42 nm。結果表明：在BPTA與HSA之間確實發生了非輻射能量轉移；同時BPTA在HSA的結合位置與Trp殘基之間的距離r值小于7 nm，這也與前面的分子模擬結果相一致。

2.6 BPTA的抗菌活性

據報道，在臨床上引起系統性真菌感染的菌株主要是念珠菌屬;致病性大腸桿菌是醫學和獸醫學臨床感染中最常見的病原菌之一;葡萄球菌是最常見的化膿性球菌，是醫院交叉感染的重要來源;枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌,是一些重要工業酶制劑的生產菌;蠟狀芽孢桿菌是常見的食品污染菌;四聯球菌是重要的食品腐敗性細菌；藤黃八疊球菌屬革蘭氏陽性細菌，是一種常用的抗生素測試菌。本文用微量稀釋法測定BPTA對以上8種病原菌的抑制活性。實驗表明,BPTA對藤黃八疊球菌，大腸桿菌沒有表現出抑制活性(呈陰性結果)，但是對其他6種菌類均存在明顯的抑制活性(呈陽性結果)。這些結果表明BPTA 可作為一種潛在的新型抗菌藥物,有待進行更深入地研究及開發應用。

3 結論

研究了新合成的三氮唑化合物BPTA的抗菌活性及其與HSA的相互作用。幾種熒光光譜法測定的結果表明BPTA的存在影響了HSA的微環境及二級結構;分子模擬確定了BPTA在HSA 上的鍵合區域及模式，位點競爭實驗確定了BPTA 在 HSA 上的位點Ⅱ鍵合。熱力學參數表明BPTA鍵合HSA的模式主要為氫鍵和范德華作用,與分子模擬的結果部分一致。獲得不同溫度下的鍵合常數說明BPTA與HSA有較強的鍵合作用。從分子水平上了解了BPTA與模型蛋白的鍵合反應及作用機制。以上的結果為進一步開發利用BPTA提供了一定的理論指導。