高效液相色譜法測定甲磺酸伊馬替尼原料藥含量

嚴拯宇， 劉新穎， 王麗麗， 廖聲華

(中國藥科大學理學院，江蘇南京 211198)

甲磺酸伊馬替尼(Imatinib Mesylate)，商品名格列衛(Glive)，是由瑞士Novartis公司研發的第一代酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine Kinase Inhibitor,TKI)，并作為全球第一個獲得批準的腫瘤發生相關信號傳導抑制劑進入臨床應用。該藥于2001年5月被英國食品藥品管理局(U.S.Feod and Drug Adninstration,FDA)批準用于治療慢性粒細胞白血病，2003年被批準用于治療胃腸道間質瘤(Gastrointestinal Stromal Tunor,GIST)，治療效果得到廣泛認可。目前，關于甲磺酸伊馬替尼的合成[1,2]及臨床應用[3]的研究較多，而對于該藥質量控制的研究并不多見，各國藥典均未收錄其原料和制劑的檢測方法?，F有文獻報道的高效液相色譜(HPLC)法測定甲磺酸伊馬替尼含量的方法中[4 - 7]，流動相多添加三乙胺或離子對試劑辛烷磺酸鈉，流動相難平衡，重現性差。

本文在參考文獻方法[8]的基礎上，建立了HPLC法測定原料藥中甲磺酸伊馬替尼含量的方法，并參照《中國藥典》(2010版)有關要求進行了方法學驗證，證實該方法簡便易行，準確度高，重現性好。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20A高效液相色譜儀(日本，島津公司)，配置SPD-M20A型二極管陣列檢測器(DAD)；BS124S型電子天平(德國，賽多利斯科學儀器有限公司)。

甲磺酸伊馬替尼對照品(含量以干燥品計為99.6%)；甲磺酸伊馬替尼原料藥(批號：20140303，20140403，20140503)，已知雜質：(1)4-(4-甲基哌嗪-1-基甲基)苯甲酸二鹽酸鹽；(2)N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺；(3)4-[(4-甲基-1-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(4)4-[(4-甲基-1，4--氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(5)4-甲基-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]-哌嗪-苯胺鹽酸鹽;(6)N-(5-甲氧基氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-嘧啶胺;(7)4-[(4-甲基-4-氧化-1-哌嗪)甲基]-N-[4-甲基-3-[4-(3-吡啶)-2-嘧啶]氨基]苯基]苯甲酰胺;(8)N-(2-甲基-5-硝基苯基)-4-(3-吡啶基)-2嘧啶胺，均由中國藥科大學醫化所提供。乙腈(色譜純，美國默克公司)；辛烷磺酸鈉(色譜純，上海凌峰化學試劑有限公司)；0.05 mol·L-1磷酸鹽緩沖溶液(PBS)：取KH2PO46.8 g，加水溶解，用H3PO4調節pH至3.0，再加水至1 000 mL。實驗用水為娃哈哈純凈水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry C18柱(150×4.6 mm，3.5 μm)；流動相A：0.05 mol·L-1PBS(pH=3.0)；流動相B：乙腈。梯度洗脫程序：0.0～20.0 min，95%～85%A；20.0～40.0 min，85%～70%A；40.0～50.0 min，70%～55%A；50.0～55.0 min，55%～55%A；55.0～56.0 min，55%～95%A；56.0～60.0 min，95%～95%A。柱溫：40 ℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量：20 μL；檢測波長235 nm。

1.3 溶液制備

1.3.1系統適用性溶液的制備根據本品的合成工藝，分析原料藥中可能引入的雜質，包括起始原料、中間體及已知降解雜質等多達8種(雜質1、2、3、4、5、6、7、8)。分別精密量取上述8種已知雜質及甲磺酸伊馬替尼對照品適量，用稀釋劑(流動相A與流動相B體積比為95∶5)稀釋，制成含已知雜質2、3、4、7 濃度約為0.2 μg·mL-1、含已知雜質1、5、6、8濃度約為0.3 μg·mL-1、含甲磺酸伊馬替尼濃度約為0.2 mg·mL-1的混合溶液。

1.3.2供試品及對照品溶液的制備取甲磺酸伊馬替尼原料藥適量，精密稱定，用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL 中約含0.1 mg的溶液，作為供試品溶液。另取甲磺酸伊馬替尼對照品適量，精密稱定，用稀釋劑溶解并定量稀釋制成每1 mL中約含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。

1.3.3有關物質溶液的制備取甲磺酸伊馬替尼原料藥適量，加稀釋劑溶解后并用其稀釋制成濃度約為0.2 mg·mL-1的溶液，作為供試液；取該試液適量，用稀釋劑稀釋定量濃度為0.2 μg·mL-1的溶液作為對照溶液。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的優化

2.1.1測定波長的選擇根據甲磺酸伊馬替尼供試品及8個已知雜質的DAD光譜掃描結果，表明樣品在235 nm波長處有最大吸收，合成的起始原料、各步中間體及降解雜質的最大吸收波長按出峰順序分別為235、235、235、235、245、245、235、274 nm，為兼顧各峰，最終選擇測定波長為235 nm。

2.1.2流動相的選擇實驗中分別選取乙腈-PBS、乙腈-PBS-三乙胺、乙腈-PBS-辛烷磺酸鈉(不同比例)作為流動相。以乙腈-PBS作為流動相時，基線平穩且分離度較好。流動相中添加三乙胺后，峰形和分離度無明顯改善，但基線噪音有所增加；添加辛烷磺酸鈉后，添加離子與帶電分析物形成中性化合物，增加了在色譜柱上的保留。以上兩種添加劑的加入均增加了色譜系統的平衡時間。

實驗還考察了流動相A的pH(2.5、3.0、3.5)對分離情況的影響。隨著pH的增加，各組分出峰時間延長，對已知雜質6與甲磺酸伊馬替尼主峰的分離度影響較大，且主峰拖尾情況也越嚴重。從分離度、峰形及色譜柱的使用壽命綜合考慮，本實驗選擇流動相A的pH為3.0。

2.2 專屬性試驗

圖1 系統適用性溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of system suitability solution

2.2.1系統適用性試驗按1.3.1項下方法配制系統適用性溶液，按1.2節色譜條件進行測定，記錄色譜圖。理論塔板數按甲磺酸伊馬替尼計為135 500N/m，甲磺酸伊馬替尼峰與已知雜質6、已知雜質7的分離度(Rs)分別為2.5和3.7，表明系統的適用性滿足要求。色譜圖見圖1。

2.2.2強制降解試驗取甲磺酸伊馬替尼供試品適量，經高溫(95 ℃，1 h)、酸(加1.0 mL 1 moL·L-1HCl，室溫1 h)、堿(加1.0 mL 1 moL·L-1NaOH，室溫1 h)、氧化(加1.0 mL 6%H2O2，室溫1 h)、光照(4 500 Lx，48 h)破壞后，用稀釋劑定容，進行測定，記錄色譜圖，結果見圖2。在酸、堿和氧化破壞下甲磺酸伊馬替尼發生了降解，所產生的降解產物與主峰分離度良好，并用DAD對主峰純度作出進一步判斷，甲磺酸伊馬替尼的色譜峰是純的。說明所建方法專屬性良好。

圖2 甲磺酸伊馬替尼與降解產物的分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of imatinib mesylate and its degradation products A.destroyed by acid;B.destroyed by alkali;C.destroyed by oxidation;D.destroyed by heating;E.destroyed by light;F.blank solvent.

2.3 線性關系考察

取甲磺酸伊馬替尼對照品約20 mg(精密稱定)，置于25 mL容量瓶中，用少量稀釋劑溶解并稀釋至刻度，精密吸取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分別置于25 mL容量瓶中，加稀釋劑稀釋并定容，得到標準系列溶液。按1.2節下色譜條件進行測定，記錄色譜圖。以濃度(x)為橫坐標，峰面積(y)為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程:y=7×107x-45674(r=0.9995)。結果表明，甲磺酸伊馬替尼在0.0168～0.1677 mg·mL-1范圍內其濃度與峰面積的線性關系良好。

2.4 定量限和檢測限

取1.3節下甲磺酸伊馬替尼對照品溶液，用稀釋劑逐級稀釋后依法測定。以信噪比(S/N)=10計算，甲磺酸伊馬替尼定量限為11 ng·mL-1；以信噪比(S/N)=3計算，甲磺酸伊馬替尼檢測限為3.3 ng·mL-1。

2.5 精密度與重復性

取1.3節下甲磺酸伊馬替尼對照品溶液，連續進樣測定6次，記錄峰面積。峰面積的相對標準偏差(RSD)為0.13%(n=6)，表明精密度良好。取甲磺酸伊馬替尼供試品(批號：20140303)適量，按1.3節下方法平行配制6份供試品溶液，依法測定，外標法計算甲磺酸伊馬替尼含量。結果顯示平均含量為99.7%，RSD為0.35%(n=6)，表明本方法重復性良好。

2.6 溶液穩定性

按1.3節下方法，將新鮮配制對照品溶液和供試品溶液，分別于室溫放置0、2、4、6、8、10、12、24 h后分別進樣測定，對照品溶液峰面積的RSD為1.2%(n=8)，供試品溶液峰面積的RSD為0.20%(n=8)，表明對照品溶液和供試品溶液在室溫下24 h內穩定。

2.7 加標回收率

取已知含量的甲磺酸伊馬替尼供試品(批號：20140303)適量，精密稱定(9份)，分別加入甲磺酸伊馬替尼對照品適量，配制其濃度分別為80%、100%、120%三個水平的供試品溶液。分別精密吸取20 μL，依法測定。以供試品加標后實際測量值減去樣品測定值之差與加標量的比值作為加標回收率，得到方法的平均加標回收率為98.9%(n=9)，RSD 為 0.67%，表明方法的回收率良好。

2.8 樣品測定

取干燥后的甲磺酸伊馬替尼供試品(批號：20140303，20140403，20140503)及對照品適量，精密稱定，按1.3節下方法分別制備含量測定溶液和有關物質檢查溶液，進行測定，并記錄峰面積，按外標法以峰面積計算含量，按自身稀釋對照法進行有關物質的測定，3批樣品的測定結果見表1。

表1 3批樣品含量及有關物質測定結果(n=3)

2.9 非水滴定法與HPLC法測定甲磺酸伊馬替尼含量比較

對于原料藥的含量測定，我們選擇非水酸堿滴定法，參照《中國藥典》2010年版二部附錄VII A電位滴定法的規定[9]，以冰乙酸∶醋酐(1∶8)為溶劑，用高氯酸滴定液(0.1 mol/L)滴定，電位法指示終點，滴定結果空白校正，并將實驗結果與HPLC法進行比較，對原料藥(批號：20140303，20140403，20140503)的含量進行了檢測。非水滴定法測得的含量為99.4%、99.6%、99.6%；兩種方法測定結果基本一致。

3 結論

本文所建立的分析甲磺酸伊馬替尼原料藥的HPLC方法，流動相組成簡單，平衡時間短，基線平穩，可使甲磺酸伊馬替尼與其他8種已知雜質全部有效分離，精密度和準確度較高，專屬性較強，重現性較好，可用于甲磺酸伊馬替尼原料藥的含量測定。