長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯分析方法研究進展

吳 琳， 魏 芳， 呂 昕， 董緒燕， 陳 洪

(中國農業科學院油料作物研究所，農業部油料作物生物學與遺傳育種重點實驗室，油料脂質化學與營養湖北省重點實驗室，湖北武漢 430062)

1 前言

長鏈多不飽和脂肪酸(Long-chain Polyunsaturated Fatty Acids，LC-PUFAs)是指分子結構中含有兩個或兩個以上不飽和雙鍵，且碳鏈長度為18～22個C的脂肪酸，主要有亞油酸(Leinoleic Acid，LA)、亞麻酸(Linolenic Acid，LnA)、二十碳四烯酸(Arachidonic Acid，ARA)、二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid，EPA)及二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)。其中，ARA、EPA及DHA在預防心血管疾病、降血脂、降低膽固醇、減肥等方面具有明顯的作用，是大腦、眼睛和整個神經系統發揮正常功能必不可少的營養物質，對人體健康非常重要[1,2]。脂肪酸根據第一個雙鍵距離甲基端位置的不同，可分為ω-3、ω-6、ω-7、ω-9等系列，攝入適量的ω-3系脂肪酸(如EPA、DHA)可預防心血管疾病，維護神經系統健康，起到抗炎等作用；攝入ω-6系脂肪酸(如ARA)可以抑制腫瘤[3]。但攝入過多含DHA的油脂，可能會通過增強膜脂質過氧化的易感性，擾亂組織抗氧化系統，進而給機體帶來不利的影響[4]。中國營養學會于2000年按年齡段對膳食中ω-6/ω-3系脂肪酸的均衡比例給出了適合中國人的平衡建議：2歲以下和60歲以上是4∶1，其它年齡是4～6∶1[5]。因此，對長鏈多不飽和脂肪酸進行種類及雙鍵位置的鑒定對脂質在營養學中的研究具有重要意義。

甘油三酯(Triacylglycerols，TAGs)是脂肪酸最主要的存在形式，占食用油組成的95%以上。TAGs是由一個甘油分子與三個脂肪酸分子縮合而成，而脂肪酸在甘油三酯中甘油骨架上的位置分布有兩類：sn-1/3(α)和sn-2(β)，脂肪酸在TAGs中的分布位置決定著油脂的功能特性及吸收代謝情況[6]。例如，Christensen等[7]研究發現，EPA及DHA處于sn-2位比處于sn-3位的吸收利用要有效得多。已有關于LC-PUFAs在甘油三酯中位置分布的文獻報道，例如，海豹油TAGs中，PUFAs主要分布在TAGs的α位，而魚油中多分布在β位[8 - 10]。因此，對LC-PUFAs TAGs中脂肪酸?；恢眠M行剖析對于揭示LC-PUFAs 的營養學特性有著重要的意義。

隨著色譜-質譜聯用技術的迅速發展，使得脂質組成及其結構的高效、高準確度和高靈敏度的分析與鑒定成為可能。但是在剖析LC-PUFAs TAGs時，除了缺少必要的標準品外，還存在其他困難。因此，需要更高效的色譜分離技術和新的質譜鑒定技術的支持[11]。本文對LC-PUFAs及LC-PUFAs TAGs的色譜分離及質譜鑒定方法進行了綜述，包括直接進樣質譜及色譜-質譜聯用技術。

2 長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的色譜分析技術

色譜技術可以快速、高效地實現脂質的分離。常用于分離脂質的色譜技術有薄層色譜法、氣相色譜法、高效液相色譜法和超臨界流體色譜法等。而用于LC-PUFAs TAGs分離的方法主要有薄層色譜法、氣相色譜法和高效液相色譜法。

2.1 薄層色譜

薄層色譜(Thin Layer Chromatography，TLC)具有操作簡單，耗資少，省時的優勢，常用于脂質種類的分離。廣泛用于油脂分離的TLC固定相有硅膠、氧化鋁、硅藻土。近年來，一些新型材料作為TLC的固定相用于分離飽和度不同的脂肪酸甲酯。Amlund等[12]在對魚油脂肪酸和甲基汞相互作用的營養進行評估時，采用高效薄層色譜(HPTLC)分離魚油樣品，使用粒徑更小的硅膠作為固定相，得到含長鏈多不飽和脂肪酸的脂質。2012年，Dillon等[13]首次提出巰醇銀(AgTCM)作為TLC的固定相材料，AgTCM-TLC與傳統Ag-TLC都是根據固定相中的Ag+與雙鍵的π電子之間的相互作用來分離飽和度不同的化合物，但AgTCM對光穩定性更強，薄層板壽命更長，AgTCM-TLC已成功應用于分離多種長鏈多不飽和脂肪酸甲酯混合物[14]。TLC法分析樣品中TAG時，首先使用合適的展開劑將樣品按照脂質種類進行分離；然后將TAG組分回收，再在含Ag+的硅膠板上根據TAG中羧酸基的飽和程度來進一步分離。隨著TLC法與可見分光光度計的結合，使得TLC可以對TAG進行定量分析。鮑方宇等[15]采用磷鉬酸作為顯色劑，通過TLC與可見分光光度計相結合的技術，準確測定了混合脂肪酸組成的TAG含量，但由于該方法分離回收的效果受硅膠板的質量、展開劑、顯色效果等因素的影響較大，因此一般只作為定性分析的一種輔助手段。

2.2 氣相色譜

2.2.1長鏈多不飽和脂肪酸的氣相色譜分析方法氣相色譜(Gas Chromatography，GC)分析TAG時，在進樣前，通常需要對TAG進行甲酯化衍生，因而甘油三酯是否完全甲酯化是準確分析油脂中脂肪酸的關鍵，而甲酯化衍生會導致TAG脂肪酸?；恢梅肿咏Y構信息的丟失，因此GC法主要用于TAGs脂肪酸組成的分析[16]。目前，GC已用于魚油[17,18]、藻油[19]和微生物油脂中含LC-PUFAs TAGs的脂肪酸組成分析。2012年，Delmonte等[20]應用新型陰離子氣相色譜毛細管柱SLB-IL111實現對脂肪酸異構體的分離，通過優化色譜條件，同時分離包括長鏈在內的多不飽和脂肪酸順反異構體和雙鍵位置異構體。Liu等[21]應用GC-MS對小鼠視網膜中長鏈多不飽和脂肪酸分析時，確定了ω-3/ω-6系脂肪酸的含量比。通過選擇不同的質譜掃描模式，比較了碳鏈長度、雙鍵數及雙鍵位置對GC-MS分析脂肪酸的質譜響應的影響，結果發現全掃描模式下，隨著脂肪酸不飽和度增高，質譜響應(峰面積)略微降低；而在選擇離子掃描模式時，響應隨不飽和度增加而增加，脂肪酸雙鍵位置對響應的影響不明顯。

2.2.2長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的GC分析方法隨著高溫氣相色譜(HTGC)固定相的出現，氣相色譜分析高沸點化合物成為可能。在柱溫大于400 ℃的情況下，HTGC與MS聯用，不需要將TAG進行甲酯化衍生，TAG按C數由小到大依次洗脫。但高溫對不飽和度相對較高的TAGs有破壞作用，因此不適合分析LC-PUFAs TAGs。Sutton等[22]使用HTGC聯用飛行時間質譜(TOF-MS)分離TAGs時，溫度達到430 ℃，具有相同碳鏈長度的甘油酯及相同雙鍵數(DBs)的甘油酯出現共洗脫現象，說明HTGC-MS無法實現對TAGs位置異構體的鑒定[23]。

2.3 高效液相色譜

2.3.1非水反相液相色譜由于甘油三酯不溶于水，因此液相色譜常采用非水流動相?；谑送榛I合硅膠固定相(商品化的C18色譜柱)的非水反相液相色譜(Non-aqueous Reversed Phase HPLC，NARP-HPLC)是分析TAG最常用的技術之一。甘油三酯在C18色譜柱中的保留取決于當量碳數(Equivalent Carbon Number，ECN)，ECN等于甘油三酯中?；溈侰數(CNs)減去兩倍的雙鍵數(DBs)，即 ECN=CN-2DB。Momchilova等[24]使用End-capped Superspher RP-18(e)柱，流動相為乙腈和乙醇，梯度洗脫，將PPL/PLP，PPLn/PLnP，PPE/PEP，PPA/PAP，PPD/PDP(其中P：C16∶0，L：C18∶2，Ln：C18∶3，E：C20∶5，A：C20∶4，D：C22∶6)完全分離。通過比較4種ODS色譜柱和6種流動相對TAG保留的影響表明，脂肪酸碳鏈長度、雙鍵數及不飽和脂肪酸的?；恢檬怯绊懕Ａ魰r間的主要原因。Lisa等[25]分別使用C18色譜柱及C30色譜柱分離黑醋栗油中TAGs，比較了不同流動相條件、洗脫梯度、柱溫對分離結果的影響。結果表明相同條件下，C18色譜柱及C30色譜柱分析黑醋栗油中TAG時，出峰時間區別不大，但是C30色譜柱的分離效果遠沒有C18色譜柱的分離效果好，只能分離得到38種TAGs，而C18色譜柱可以分離得到83種TAGs；C30色譜柱與C18色譜柱相比，不能分離含α-亞麻酸和γ-亞麻酸的LC-PUFAs TAG雙鍵位置異構體；柱溫不會改變C18色譜柱分離TAG的出峰順序，但可以改變C30色譜柱分離TAG的出峰順序；不同初始流動相條件、不同洗脫梯度只會造成保留時間偏移，但不會影響TAG的出峰順序。

2.3.2Ag+液相色譜Ag+液相色譜(Ag-HPLC)是一種特殊的正相色譜，常作為NARP-HPLC分離的互補方法。Ag-HPLC常用于分離TAGs異構體，其分離原理是根據固定相中的Ag+與TAG中雙鍵的π電子之間的電荷轉移作用分離TAGs，因此TAGs中雙鍵數目及位置決定著保留時間。Holapeka等[26]通過串聯三根Ag+液相色譜柱(ChromSpher Lipids,Varian,USA)分離TAGs雙鍵位置異構體及脂肪酸?；恢卯悩嬻w，分別聯用5種不同類型的質譜檢測器，并對分析結果進行了比較。結果表明，檢測器的類型對得到的碎片離子豐度比的影響低于脂肪酸的雙鍵數目、雙鍵位置及?；溤诟视凸羌苤械姆植嘉恢脤Φ玫降乃槠x子豐度比的影響。同時也表明串聯三根Ag+液相色譜柱仍無法分離sn-2位TAG雙鍵位置異構體(如Lα-LnL與Lγ-LnL)[27,28]。

Ag-HPLC分離TAG時的分離效率受三個因素影響：流動相組成、柱溫及色譜柱性能[29]。合適的流動相能顯著提高Ag-HPLC分離TAG異構體的分離效率，而柱溫對TAG異構體在Ag+色譜柱中保留時間的影響相當復雜。目前Ag-HPLC使用的色譜柱主要為商品化Spher Lipids色譜柱[30]。但常規Ag+色譜柱對多不飽和TAGs的分析都表現出低重現性，且無法實現雙鍵數大于7的TAG異構體的分離，對于雙鍵數更多的TAGs，出峰時間很長甚至不出峰。

Leskinen等[31]通過將Ag+鍵合于EC 250/4.6 Nucleosil 100-5 SA色譜柱，成功分離黑加侖籽油中Ala/L/L與Gla/L/L(Ala為α-亞麻酸，Gla為γ-亞麻酸，L為亞油酸)雙鍵位置異構體。Dillon等[32,33]將Ag+鍵合到3-巰基丙基固定相上制備硫醇銀(AgTCM)液相色譜柱，其分離原理與Ag+的分離原理相似，都能按照雙鍵數不同將分析物分離。由于硫醇和Ag+形成了較強的配位化合物，使得AgTCM色譜柱的穩定性及分析物保留時間的重現性較常規Ag+色譜柱更佳，但目前只應用于長鏈多不飽和脂肪酸乙酯的分離。

Ag-HPLC雖然可以分離TAG?；恢卯悩嬻w及雙鍵位置異構體，但分離含EPA和DHA等LC-PUFAs TAGs位置異構體仍然是一個難題[34]，通常需要串聯兩根或兩根以上的Ag+色譜柱，但也只能實現部分TAG異構體分離，不僅耗時，而且增加了分析成本。

表1列出了文獻中已報道的不同液相色譜柱分離鑒定長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的研究及其應用。

表1 不同液相色譜柱分離長鏈多不飽和脂肪酸甘油三酯的應用

3 LC-PUFAs TAGs的直接進樣質譜鑒定技術

直接進樣MS應用最廣泛的電離源是電噴霧電離(Electronic Spray Ion，ESI)和基質輔助激光解吸電離(Matrix-assisted Laser Desorption Ionization，MALDI)。MS成像技術可以提供形象化的脂肪酸分布信息，Shah等[50]應用此方法已形象化的鑒定了人血漿中不飽和度為3的TAG分子。由于其可視化的優點，常被用于生物樣品分析，主要用于多種生物樣品中LC-PUFAs磷脂分子分析。

3.1 電噴霧電離質譜

近年來，也有很多新型技術應用于ESI-MS中，用于鑒定LC-PUFAs TAGs。2012年，Pham等[55]首次將原子團定向解離方法應用于油脂分析，通過向TAG異構體中添加4-碘苯胺(IA)形成[TAG+IA]+，在一定的CID作用下，[TAG+IA]+發生α斷裂與β-裂解，因而產生不同的碎片離子，根據這些碎片離子可鑒定TAG中脂肪酸位置和雙鍵位置，應用該方法已成功鑒定了含亞麻酸的TAG?；恢卯悩嬻w及雙鍵位置異構體。

3.2 基質輔助激光解吸電離質譜

近年來，MALDI-MS已越來越多用于脂質分析。同ESI-MS一樣，這項技術已應用于分析磷脂[56]、TAGs[57]以及脂肪酸[58]。MALDI與ESI-MS不同的是對所有的脂質都能產生正離子，使得在一個圖譜中能觀察到寬范圍的脂類。MALDI的優勢在于其對基質的耐受性，如緩沖鹽等，且適合大量樣品的生物學分析?？梢酝ㄟ^添加相應的鹽產生[M+H]+、[M+Na]+、[M+K]+等離子。Kubo等[59]采用單一同位素前體離子模式分析橄欖油中的TAG，通過高能量的碰撞誘導解離(CID)使加鈉TAG產生遠電荷碎裂，提高了前體離子選擇性，實現TAG更完整的分析。Danielewicz等[60]利用MALDI技術分析了微藻油中TAGs的組成，鑒定出C數為18和20，雙鍵數最高為4的多不飽和脂肪酸，同時也指出由于MALDI常與飛行時間質量分析器(TOF)聯用，其靈敏度很高，對每個TAGs相似物都有響應，不適合用于定量含長鏈多不飽和脂肪酸的TAGs。MALDI-MS需要合適的基質才能獲得好的重現性及靈敏度，其定性定量能力不如ESI-MS和大氣壓化學電離質譜(APCI-MS)。

4 LC-PUFA TAG不同分析方法的比較

常用于分離LC-PUFA TAG的色譜方法有：TLC、HTGC、HPLC及2D-LC。TLC具有操作簡單、成本低廉、對設備要求低等優點，但利用該方法分離甘油三酯時，分離回收的效果受硅膠板、擴展劑及操作水平等因素的影響較大，且定量困難。HTGC可以直接分析TAG，TAG在耐高溫的氣相色譜柱上按C數由小到大依次洗脫，但長鏈多不飽和脂肪酸在高溫下容易發生熱降解，因此HTGC更適合用于分析相對飽和的TAG。NARP-HPLC法可以實現對具有不同ECN值TAGs的有效分離，但是難以分離具有相同ECN值的TAG，對TAG位置異構體的分離選擇性也較差。Ag+色譜可以根據甘油三酯的雙鍵數目、雙鍵位置等因素將ECN值相同的甘油三酯進行分離，是非水反相液相色譜法的有效補充，TAG雙鍵數越多，在Ag+色譜柱上的保留時間越長，串聯三根Ag+色譜柱仍無法實現雙鍵數大于7的LC-PUFA TAG位置異構體的分離[61]。將NARP-HPLC和Ag-HPLC兩種不同保留機理的分離模式離線或在線聯用，構建2D-HPLC分離系統，是實現TAG高選擇性分離的有效途徑。此外，最近有研究采用無封端聚合ODS柱(Non-endcapped Polymeric ODS，ODS-P)實現了對LC-PUFA TAG位置異構體的分離。

5 LC-PUFAs TAGs的定量手段

5.1 LC-PUFAs TAGs的定量方法

胡珺等[36]研究發現，雙鍵數大于3和小于3的TAG在質譜上的響應有著很大的差別，進而將食用油中的甘油三酯根據不飽和度不同分為兩組(不飽和度大于等于3和小于3)，通過選取各組中具有代表性的7種甘油三酯標準品建立標準曲線，最后選取與目標TAGs結構最為相似的標準品所對應的標準曲線對TAGs進行定量分析。該類比標準曲線定量方法有效地克服了不同結構甘油三酯質譜峰響應差別比較大的問題，解決了需要對所有甘油三酯都建立標準曲線以達到其量化的問題。此外，還有少數文獻報道了使用響應因子對甘油三酯進行定量分析的方法。Li等[62]在定量擬南芥中TAG時，采用ESI-MS多重中性丟失掃描模式，以相同C數，不同雙鍵數的TAGs以及不同C數，相同雙鍵數的TAGs在質譜上的相對響應因子(設十七碳烯酸三甘油酯的響應因子為1)繪制標準曲線，共定量了擬南芥種子中93個TAGs分子。

5.2 LC-PUFAs TAGs異構體的定量方法

目前主要有三種方法用于定量分析TAG異構體。最早用于定量分析TAGs異構體的方法是利用酶的選擇性水解作用。雖然酶對立體定向位置和特定碳鏈長度脂肪酸的選擇性是已知的，但是準確地應用酶的立體選擇性依賴于實驗條件，通常不能實現直接定量。第二種方法是色譜分離TAGs異構體，聯用質譜檢測器進行鑒定，但是LC-PUFAs TAG異構體的色譜分離仍是一大難題。第三種方法，液相色譜-串聯質譜法，不需要實現對異構體的分離，通過建立不同濃度比的異構體標準品與碎片離子豐度比的標準曲線來進行定量。Herrera等[39]利用LC-ESI-MS3建立多種含EPA和DHA的長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯不同含量比與碎片離子豐度比的標準曲線，成功確定EPA，DHA在魚油TAG中?；恢?，實現對實際油脂樣品中特定異構體的定量分析。Ramaley等[63]分別將每對LC-PUFAs TAGs?；恢卯悩嬻w標準品混合進樣，建立異構體濃度百分比與碎片離子豐度比的曲線關系，即檢測到的碎片離子豐度比對應為異構體對中一個異構體的濃度百分比，用該方法實現了實際樣品中異構體各組分的定量，同時也發現所建立的含有EPA 、DHA 的四對甘油三酯?；恢卯悩嬻w的曲線為非線性關系。

6 結論與展望

色譜與質譜技術的迅速發展，已能實現對許多甘油酯的組成及結構的高效、高準確度和高靈敏度的分離鑒定。但對具有較高營養價值，易氧化的長鏈多不飽和脂肪酸甘油酯的分析仍存在諸多挑戰。首先，缺少高純度的LC-PUFAs TAGs異構體標品，而合成這樣的異構體需要花費高額的費用，成為限制其鑒定的主要原因；其次，LC-PUFAs TAGs不飽和度較高，碳鏈較長，質譜裂解機制復雜，分離鑒定難，進而增加了定量難度。因此對LC-PUFAs TAGs的研究方向包括：建立LC-PUFAs TAGs異構體的合成方法，大力開發和優化各種色譜分析手段與質譜技術的聯用，完善快速、高通量、高靈敏度的剖析LC-PUFAs TAGs的方法，并進一步完善定量分析方法。