抗枇杷根腐病病菌的6株枇杷主干內生真菌生物學特性研究

陶宏征等

摘要：為篩選適合工業發酵的抗枇杷根腐病病菌中的枇杷主干內生真菌菌株，對抗枇杷根腐病病菌的6株枇杷主干內生真菌進行生物學特性研究。結果表明：在參試菌株中，DPZG15菌株生長適應性最強，對pH值、光無特殊要求，在馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基、麥芽糖或蔗糖為碳源、牛肉膏或酵母膏為氮源、25～28 ℃條件下生長達到最佳水平。

關鍵詞：枇杷；內生真菌；枇杷根腐??；生物學特性

中圖分類號： S436.67+9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2015）09-0166-03

枇杷（Eriobotrya japonica）為薔薇科常綠喬木果樹，是我國亞熱帶地區的特色水果[1]，含川貝堿、西貝素等多種生物堿[2]。植物內生真菌普遍存在于各種植物健康組織內或細胞間隙，不僅能促進寄主植物生長，還可以產生與寄主相同或相似的次級代謝產物，具有抗菌、殺蟲等多種生物活性[3-6]。目前，尚未見枇杷內生真菌的研究報道。枇杷根腐病是枇杷生產上發生嚴重而普遍的土傳病害之一，其田間癥狀初期表現出樹勢衰退，葉片起初變黃，之后變成褐色；葉子在脫落之前緩慢下垂；偶爾下大雨時，植株發病較快，只留下褐色干枯的葉片掛在死樹枝上；莖干顏色呈暗褐色，基部腐爛，韌皮部呈魚鱗狀；地上部維管組織呈紅褐色；后期植株萎蔫、樹皮脫落，最后整株枯死。臺灣[7]、福建[8]、云南[9]等省份陸續報道有枇杷根腐病發生，損失率高達40%以上，且有逐漸加重之勢，制約著枇杷產業發展?；瘜W防治對于土傳病害收效甚微，加上化學農藥不符合綠色農業生產要求，生物防治日趨受到人們的重視。鑒于此，本研究從枇杷主干內生真菌中挑選對枇杷根腐病病菌抑制率高于50%的菌株[10]，對其進行生物學特性研究，為其工業發酵提供理論依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1枇杷主干內生真菌從蒙自枇杷園區采集枇杷主干韌皮部，常規組織分離[11]獲得6株參試菌株，其中菌株DPZG11、DPZG12、DPZG13、DPZG14、DPZG15、DPZG16 均為枝頂孢屬（Acremonium）。

1.1.2 供試培養基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：200 g 馬鈴薯、16 g葡萄糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基（PSA）：200 g馬鈴薯、16 g蔗糖、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；胡蘿卜瓊脂培養基（CA）：200 g胡蘿卜、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；玉米瓊脂培養基（MA）：30 g 玉米、17 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；小麥瓊脂培養基（WA）：30 g小麥、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；枇杷瓊脂培養基（LA）：200 g枇杷葉、20 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水；察氏 培養基：2.00 g硝酸鈉、1.00 g磷酸二氫鉀、0.50 g氯化鉀、0.50 g七水硫酸鎂、0.01 g硫酸鐵、30.00 g蔗糖、20.00 g瓊脂粉、1 000 mL蒸餾水。所用試劑均為分析純。

1.1.3試劑碳源為可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇；氮源為酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨；均為分析純。

1.2試驗方法

1.2.1測定不同培養基對參試菌株菌絲生長的影響將枇杷主干內生真菌在PDA平板培養基中，28 ℃恒溫擴大培養 7 d[11]，在培養基同一半徑周圍用打孔器取直徑為5 mm的菌餅，同時接種于PDA、PSA、CA、MA、WA、LA 6種培養基平板中央，設3次重復，在28 ℃下恒溫培養，7 d后用十字交叉法[11]測定各菌株菌落直徑。

1.2.2測定碳、氮源對參試菌株菌絲生長的影響以查氏培養基為基礎培養基，分別用相等質量分數的碳源（可溶性淀粉、麥芽糖、α-乳糖、葡萄糖、甘露醇）和氮源（酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、尿素、硫酸銨、硝酸銨、磷酸二氫銨）替換蔗糖和硝酸鈉，接種及測量方法同“1.2.1”節相關步驟[11]。

1.2.3測定不同pH值對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養基，用0.1%鹽酸、0.1%氫氧化鈉將pH值調至4、5、6、7、8、9、10，接種及測量方法同“1.2.1”節相關步驟[11]。

1.2.4測定不同溫度對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養基，接種后分別在5、10、15、20、25、30、35、40 ℃下恒溫培養，接種及測量方法同“1.2.1”節相關步驟[11]。

1.2.5測定不同光處理對參試菌株菌絲生長的影響以PDA為供試培養基，接種后分別在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下培養，接種及測量方法同“1.2.1”節相關步驟[11]。

以上所有培養基用高壓蒸汽滅菌鍋121 ℃滅菌25 min。

1.2.6數據統計所有試驗數據均采用SPSS 19.0軟件的Duncans多重比較法進行統計分析，計算處理間的差異顯著性。

2結果與分析

2.1不同培養基對參試菌株菌絲生長的影響

表1顯示，參試菌株DPZG11在PDA、PSA 2種培養基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養基間差異顯著，在其余2種供試培養基差異極顯著；DPZG12、DPZG13在CA、MA 2種培養基間菌落直徑差異不顯著，但與其余4種供試培養基差異極顯著；DPZG14在PSA、MA 2種培養基間菌落直徑差異不顯著；DPZG15在供試的6種培養基間菌落直徑差異極顯著；DPZG16在PSA、CA 2種培養基間菌落直徑差異不顯著，在WA、LA 2種培養基間差異也不顯著，但與其余2種供試培養基差異極顯著。其中，菌株DPZG14、DPZG16 菌絲生長最適合的培養基為PDA，菌株DPZG12、DPZG13菌絲生長最適合的培養基為PSA，DPZG15菌絲生長最適合的培養基為CA，DPZG11菌絲生長最適合的培養基為PDA或PSA。結果說明，參試菌株營養適應性存在多樣性。

2.2不同碳源對參試菌株菌絲生長的影響

由表2顯示，參試菌株DPZG11在供試的6種碳源間菌落直徑差異極顯著；DPZG12在葡萄糖、蔗糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在可溶性淀粉、甘露醇2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與α-乳糖差異極顯著；DPZG13在葡萄糖、α-乳糖2種碳源間菌落直徑差異不顯著，但與其余3種供試碳源差異極顯著；DPZG14在麥芽糖、甘露醇2種碳源中菌落直徑差異不顯著，在葡萄糖、α-乳糖 2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與可溶性淀粉差異極顯著；DPZG15在葡萄糖、可溶性淀粉2種碳源間菌落直徑差異不顯著，在蔗糖、麥芽糖2種碳源間菌落直徑差異也不顯著，但與其余2種供試碳源差異極顯著；DPZG16在葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉3種碳源中菌落直徑差異不顯著，所有碳源均與α-乳糖差異極顯著。其中，DPZG11、DPZG13菌株菌絲生長最適合的碳源為麥芽糖，DPZG14最適合的碳源為可溶性淀粉，DPZG15最適合的碳源為蔗糖或麥芽糖，DPZG16最適合的碳源為蔗糖或甘露醇，DPZG12在不添加碳源的培養基中菌落直徑最大，對碳源無依賴性，結果表明，參試菌株碳源適應性同樣存在多樣性。

2.3不同氮源對參試菌株菌絲生長的影響

由表3顯示，參試菌株DPZG11在硫酸銨、尿素2種氮源

2.5不同溫度對參試菌株菌絲生長的影響

由表5顯示，參試菌株在10～35 ℃范圍內均能生長。DPZG11菌株菌絲生長最適合的溫度為25～30 ℃；DPZG12最適合的溫度為25 ℃；DPZG13、DPZG14最適合的溫度為30 ℃；DPZG15最適合的溫度為25～28 ℃；DPZG16最適合的溫度為20 ℃。說明各參試菌株的溫度適應性也存在差異。

2.6不同光處理對參試菌株菌絲生長的影響

由表6顯示，在光暗交替（12 h光照、12 h黑暗）、全黑暗、全光照3種光處理下，DPZG11、DPZG12、DPZG15菌株菌落直徑均達90.0 mm，生長不受光的影響；DPZG13、DPZG14在全光照時菌落直徑最大；DPZG16菌株全黑暗最適合其菌絲生長。說明參試菌株對光的適應性也存在差異。

3結論與討論

在6種供試培養基中，PDA、PSA、CA培養基最適合各參試菌株菌絲生長，此研究結果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內生真菌的研究結果[12]一致。在供試碳源中，麥芽糖、可溶性淀粉、蔗糖、甘露醇最適合各參試菌株菌絲生長，此結果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內生真菌的研究結果[12]不一致。在供試氮源中，牛肉膏、酵母膏、蛋白胨最適合各參試菌株菌絲生長，此結果與筆者所在課題組報道的其余6株枇杷內生真菌[12]、銀杏內生真菌[13]的研究結果一致。20～30 ℃最適合各參試菌株菌絲生長，此結果與鹿蹄草屬內生真菌的研究結果[14]不一致。DPZG12、DPZG15生長不受pH值及光照限制，其他4個菌株最適合的pH值及光照各不相同，此研究結果與筆者所在課題組報道的另外6株枇杷內生真菌的研究結果[12]不一致。試驗結果表明，枇杷主干中的各內生真菌菌株生長喜好不盡相同，其中DPZG15菌株生長適應性最強，較其他菌株更具開發應用優勢。

各參試菌株均為枝頂孢屬真菌，葉利芹等曾研究赭紅枝頂孢（Acremonium salmoneum）培養條件[15]及其竹葉銹病菌的重寄生作用[16]。枝頂孢屬作為殺蟲生防制劑的研究也有報道[17-18]。另外，黎起秦等用針刺接種法和浸根法將內生菌B47成功地定殖到番茄體內[19]。江木蘭等通過浸種法把油菜內生生防菌BY-2定殖到油菜體內[20]。李紅剛等又通過研磨組織涂抹法把內生放線菌定殖植株體內[21]。而定殖的生防菌株受到植物組織的良好保護[22]，這為今后DPZG15定殖到植株體內提供了理論支持和經驗借鑒。

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