豇豆產量性狀與SSR分子標記的關聯分析

潘磊等

摘要：利用156對多態性豇豆[Vigna unguiculata（L.）Walp.]簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）引物檢測83份豇豆種質材料基因組，分析群體遺傳結構，并對14個豇豆產量性狀與SSR標記進行全基因組關聯分析。結果表明，群體遺傳結構分析將83份豇豆樣品劃分為2個亞群。關聯分析則有10個SSR標記位點與8個性狀關聯，主要分布在LG2、LG3、LG4、LG7、LG11連鎖群上。這些關聯位點在豇豆基因組上分布不均，對關聯性狀的表型變異解釋率為9% （CLM0022）～33%（CLM0347）；有1個標記（CLM0251）與多個性狀關聯；另外也有同一個性狀與多個SSR標記關聯，包括葉寬（CLM0251、CLM0850），單莢重（CLM0347、CLM0251、CLM0614）。這些與豇豆性狀關聯的SSR標記將為豇豆分子育種和遺傳改良提供依據。

關鍵詞：豇豆[Vigna unguiculata（L.）Walp.]；產量性狀；簡單重復序列；關聯分析

中圖分類號：S643.4；Q343.1+5；Q348 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-3952-07

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.031

Association Analysis between Yield Trait in Cowpea and SSR Molecular Markers

PAN Lei，LI Yi，YU Xiao-lu，GUO Rui，CHEN Chan-you

（Hubei Province Engineering Research Center of Legume Plants/School of Life Sciences，Jianghan University，Wuhan 430056，China）

Abstract： Correlation of yield traits and molecular markers in cowpea [Vigna unguiculata（L.）Walp.] were investigated by using mixed line model in genome-wide association study. A set of 156 polymorphic Simple sequence repeat （SSR） markers were applied to genotyped 83 typical cowpea accessions. Based on the polymorphic data， population genetic structure analysis revealed two sub-populations revealed in the experimental 83 samples. After association analysis was performed between 14 yield traits in cowpea and the 156 polymorphic SSR molecular markers，ten SSR were found to be significantly associated with eight yield traits. These markers distributed in different linkage groups，including LG2，LG3，LG4，LG7，LG11， which explained 9%（CLM0022）～33% （CLM0347） of the observed phenotypic variance.There were one SSR markers （CLM0251） associated with two or more traits. On the other side， there two yield traits correlated with two or more SSR markers，including leaf width （CLM0251 and CLM0850） and single pod weight （CLM0347，CLM0251 and CLM0614）.These SSR marker related with cowpea traits will be useful for molecular breeding and genetic improvement in cowpea in the future.

Key words： cowpea[Vigna unguiculata（L.）Walp.]； yield trait； Simple sequence repeat； association analysis

豇豆[Vigna unguiculata（L.） Walp.]是一種重要的豆科（Leguminosae）蔬菜作物之一，其嫩莢和種子可供食用，是日常飲食中植物蛋白質和膳食纖維的重要來源之一。中國的豇豆栽培歷史悠久，資源類型多樣，遺傳變異豐富。目前，中國農業科學院國家農作物種質資源保存中心（http：//icgr.caas.net.cn/）已搜集保存了1 000份以上的豇豆種質資源；而這些豇豆資源中，生長習性以蔓生、半蔓生和矮生類型為主，花色多為紫色或白色，鮮莢顏色有深綠、淺綠、白色、紅色、紫紅色、龍紋等，諸多優異農藝性狀可用作遺傳改良資源。探究遺傳變異的基礎，挖掘優異等位基因或性狀連鎖的遺傳位點，將是豇豆種質資源與分子育種中的重要研究方向之一，關聯分析（Association analysis）為此提供了一個十分有效的研究方法，關聯分析是近年發展起來的一種高通量分析表型與遺傳多態性之間關聯性的遺傳分析方法，能在群體水平上大量發掘與目標性狀相關的基因及其等位基因。2001年關聯分析首次用于植物研究[1]，之后逐漸成為植物數量性狀遺傳研究的熱點之一。關聯分析又稱為關聯作圖（Association mapping），或連鎖不平衡作圖（Linkage disequilibrium mapping，LD mapping），是以基因或者位點之間的連鎖不平衡為基礎，從而篩選鑒定出某一群體內的目標性狀與遺傳標記或候選基因，主要有基于候選基因的關聯分析和全基因組關聯分析兩種策略[2]。關聯分析中多采用混合線性模型（Mixed liner model，MLM），因為此模型兼顧群體結構和系譜關系，能顯著降低誤差[3]。目前尚未見到豇豆研究應用關聯分析的報道，但是豇豆資源的亞群中存在一定的遺傳結構和較高的連鎖不平衡（LD）水平[4]。理論上位點之間連鎖越緊密，LD水平則越高，而LD較高的物種或群體應用較少的標記即可實現全基因組掃描。此外，自花授粉的物種，在經歷了瓶頸效應和強烈的人工選擇后，群體中僅包含所有群體中少部分的等位基因，這更適宜于全基因組關聯分析的應用[5]。豇豆是典型的自花授粉植物，基因組較?。s587 Mb）[6]，群體內的LD水平較高。因此，全基因組掃描的關聯分析可以應用在豇豆研究中。

多態性DNA分子標記是開展全基因組關聯分析的前提。與RADP、AFLP、ISSR等分子標記相比較，簡單重復序列（Simple sequence repeat，SSR）分子標記由于在基因組上分布廣、經濟方便、多態性高、重復性好、易于基因分型等優點，在植物中的應用備受青睞。在豇豆的DNA分子標記研究中，國內外的研究者陸續報道了運用多種DNA分子標記（RAPD、RFLP、AFLP和SSR等）技術構建了豇豆的連鎖遺傳圖[7-12]，這些遺傳圖譜的標記雖然數量少，但為豇豆基因組的進一步研究奠定了基礎。

試驗選取了全國范圍內的83份具代表性的豇豆種質材料，對豇豆產量的相關性狀，包括商品成熟莢相關的性狀（鮮莢莢長、鮮莢莢厚、鮮莢單莢重、首莢節位和單株結莢數等）以及儲藏期的干種子相關性狀（千粒重、種子長和種子寬等）進行了有重復的表型鑒定，利用豇豆全基因組上均勻分布的175對SSR分子標記，進行產量性狀與SSR標記的亞群聚類和關聯分析?；诠┰嚥牧蟻碓床煌蚐SR分子標記的多態性、一個關聯位點的多個等位變異（多態性條帶）能對應多少個表型性狀等的特異性，來篩選出優異的等位變異，現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 群體的選擇

試驗所用的83份豇豆種質材料均來自江漢大學湖北省豆類蔬菜植物工程技術研究中心，其性狀表型穩定，基本情況見表1。分別在武漢市東西湖區柏泉農場和武漢市蔡甸區永安街柏木村，連續進行兩年三季（2012年秋季、2013年春季和秋季）田間試驗，觀測記錄豇豆產量的相關性狀。所有樣品的春播為4月，秋播為7月，田間管理為常規方法。

1.2 表型性狀的測定與分析

試驗測定了14個與豇豆產量相關的性狀，包括商品成熟莢性狀6個（鮮莢單莢長、葉寬、鮮莢莢厚、鮮莢單莢重、首莢節位、單株結莢數）和干種子形態性狀8個（千粒重、種子面積、種子周長、種子長/寬、種子長、種子寬、種子直徑、種子圓度），每個性狀的測定有3次生物學重復。商品成熟莢性狀的測定參照王佩芝等[13]的方法；干種子采用萬深SC-E型種子外觀品質檢測分析儀系統（杭州萬深檢測科技有限公司）測量種子的形態性狀。此外，采用電子天平稱量干種子百粒重，然后換算為千粒重。將測定的性狀匯總后，錄入到Microsft Office Excel 2010軟件里，計算各性狀在品種內和品種間的變異系數。

1.3 SSR分析

1.3.1 基因組總DNA提取 選取豇豆嫩葉，用改進的CTAB法提取基因組總DNA[14]，于-20 ℃環境下保存備用。采用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測定DNA的質量和濃度。

1.3.2 引物篩選 挑選豇豆全基因組分布的175 對SSR引物[11]，并委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成引物，篩選具備多態性SSR引物，用于供試樣品的擴增分析。

1.3.3 PCR擴增反應 PCR總體系為20 μL，其中包含20 ng DNA模板，引物10 pmol，4 nmol dNTPs，30 nmol MgCl2，0.5 U Taq DNA聚合酶（上海博彩生物科技有限公司），10×PCR Buffer，其余體積用ddH2O補齊。在Eppendorf Mastercycler gradient PCR擴增儀（德國艾本德中國有限公司）上進行PCR擴增反應，擴增條件：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環；最后72 ℃延伸5 min。以100 bp DNA Ladder作為參照，記錄擴增片段的大??；此外，按照0/1二進制的方法，將有條帶的記作1，無條帶的記作0，錄入到Microsft Office Excel 2010中形成數據矩陣。

1.4 數據分析

采用STRUCTURE 2.3軟件（http：//pritchardlab.stanford.edu/structure.html）分析供試豇豆群體的遺傳結構，基于數學模型劃分亞群，計算相應的Q值。主要分析步驟為：采用Admixed model模式，K值（亞群數目）設為1～12，參數Iterations設為10 000，Burn in-period設為100 000。每個K值重復運行5次，然后計算出每個K值對應的后驗概率lnP（D）值。通過分析ΔK值的變化規律，來判別合適的K值作為亞群數目[15]。運用SPA Gedi1.2軟件計算83份豇豆種質材料兩兩之間的親緣系數，進行Kinship分析[16]。

SSR位點與豇豆產量性狀的關聯分析中，采用TASSEL 2.2軟件的MLM模型分別進行多態性SSR位點與豇豆產量性狀的關聯分析[17]。主要步驟為：以Q值和Kinship系數矩陣作為協變量，綜合156對多態性豇豆SSR引物獲得的等位基因位點、亞群分類結果（依據K值）和表型數據，計算獲得每個位點的顯著性水平及其對表型變異的解釋率。以P-Maker值來衡量關聯標記的顯著性，試驗選擇的顯著水平為P<0.01。

2 結果與分析

2.1 表型性狀的遺傳變異分析

試驗測定的豇豆鮮莢單莢長、葉寬、鮮莢莢厚、鮮莢單莢重、首莢節位、單株結莢數以及千粒重、種子面積、種子周長、種子長/寬、種子長、種子寬、種子直徑、種子圓度14個與豇豆產量相關的表型性狀變異統計結果見表2。從表2可見，供試的83份豇豆種質材料中14個產量相關性狀存在明顯的遺傳變異；其中變異程度最大的性狀為單株結莢數，其變異系數為79.98%，其次是鮮莢單莢重，其變異系數為71.74%，而干種子長/寬的變異程度最小，變異系數僅為7.87%，就各個性狀而言，遺傳變異的差別十分明顯。在與鮮莢產量相關的6個性狀中，鮮莢單莢長度的變異范圍為14.13～80.64 cm，平均為38.70 cm；葉寬的變異范圍為1.04～7.62 cm，平均在4.47 cm；鮮莢莢厚的變異范圍在0.58～1.32 cm，平均在0.73 cm；鮮莢單莢重的變異范圍在4.57～56.38 g，平均為17.04 g；首莢節位變異范圍在1～6節，平均首莢節位為2節；單株結莢數變異范圍在1～33個，平均結莢數約為11個。

在與干種子產量相關的8個性狀中，千粒重變異范圍在84.70～352.84 g，平均為144.73 g；干種子面積變異范圍在15.53～548.03 mm2，平均在215.51 mm2；干種子周長變異范圍在9.39～57.89 mm，平均為33.92 mm；干種子長/寬變異范圍為1.43 ～2.05，平均為1.73；干種子長度變異范圍在3.46～19.69 mm，平均為11.29 mm；干種子寬度變異范圍在1.86～11.41 mm，平均為6.54 mm；干種子直徑變異范圍為2.66～15.55 mm，平均為8.93 mm；干種子圓度變異范圍在0.47～0.70，平均為0.56。

2.2 遺傳多樣性分析

試驗從175 對豇豆基因組SSR引物中篩選出了156 對多態性引物，并用于83份豇豆種質材料的擴增分析，結果見表3。檢測結果表明，每對多態性引物中等位基因數為2～9個/SSR位點，平均為2.91個/SSR位點；觀察雜合度的變異范圍在0.00～1.00，平均觀察雜合度為0.09；期望雜合度的變異范圍在0.03～0.73，平均期望雜合度為0.33。據此可見，供試豇豆種質材料的遺傳多樣性水平為中等偏低。

2.3 群體遺傳結構和親緣關系聚類分析

83個豇豆種質材料基于多態性SSR位點和數學模型的群體遺傳結構K值分析結果見圖1。從圖1可見，采用STRUCTURE 2.3軟件建立的數學模型中，當K=2時，其模型的后驗概率lnP（D）最大，即符合Hardy-Weinberg平衡的亞群數為2。據此，可將83個豇豆種質材料群體分為2個亞群，詳情見圖2。群體結構的存在會影響LD，從而造成關聯分析結果的真實性和準確性，因此，將各個品種的Q值作為協變量，加入SSR分子標記與表型性狀的關聯分析中。

2.4 標記與性狀的關聯分析

豇豆產量性狀與SSR分子標記位點的關聯分析結果見表4，與產量性狀顯著關聯的10個豇豆基因組SSR標記信息見表5，表4、表5中的連鎖圖數據引自文獻[11]。從表4可見，10個SSR標記位點與8個豇豆產量性狀相關聯，與商品成熟莢產量性狀（鮮莢單莢長、葉寬、鮮莢單莢重、首莢節位、單株結莢數）相關的位點有8個，分布于連鎖群LG2（鮮莢單莢長，標記位點CLM0068；鮮莢單莢重，標記位點CLM0347）、LG3（鮮莢單莢重，標記位點CLM0614；單株結莢數，標記位點CLM1182）、LG4（葉寬，標記位點CLM0251；鮮莢單莢重，標記位點CLM0251）、LG7（首莢節位，標記位點CLM0445）、LG11（葉寬，標記位點CLM0850）；與干種子形態（千粒重、種子寬、種子圓度）相關的位點3個，分布于LG3（千粒重，標記位點CLM0022）、LG10（種子寬，標記位點CLM0546；種子圓度，標記位點CLM0589）。

這些與表型性狀相關聯的SSR位點在豇豆基因組上的分布不均衡。與豇豆鮮莢單莢長度相關的位點1個，位于連鎖群LG2；與葉寬相關聯的位點有2個，分別位于連鎖群LG4和LG11；與鮮莢單莢重相關聯的位點有3個，分別位于連鎖群LG2、LG3和LG4；與首莢節位相關聯的位點1個，位于連鎖群LG7；與單株結莢數相關聯的位點1個，位于連鎖群LG3；與千粒重相關聯的位點1個，位于連鎖群LG3；與種子寬相關聯的位點1個，位于連鎖群LG10；與種子圓度相關聯的位點1個，位于連鎖群LG10。這些標記對關聯性狀的表型變異解釋率范圍為9%（CLM0022）～33%（CLM0347），解釋率越高說明關聯程度越大；其中，以千粒重（9%）最低，鮮莢單莢重最高（33%）。

3 小結與討論

近年來，在DNA分子水平上對豇豆的研究越來越受到關注[18]。盡管如此，與其他豆科農作物相比較，豇豆的分子水平研究基礎與應用研究還十分滯后[19]。比如，豆科中的百脈根（Lotus corniculatus L. var. japonicus Regel）、大豆[Glycine max（L.）Merr.]、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）、木豆[Cajanus cajan（L.）Millsp.]、鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）、菜豆（Phaseolus vulgaris L.）、綠豆[Vigna radiata（L.）Wilczek]和紅小豆[V. angularis（Willd.）Ohwi et Ohashi]等均已完成全基因組測序，為豆科植物深入研究基因組結構、發掘功能基因和分子輔助育種等研究奠定了堅實的基礎。豇豆中尚未開展基因組測序，因此，篩選豇豆基因組上多態性DNA分子標記技術、探究表型性狀與分子標記的關聯性、發掘與性狀顯著關聯的分子標記、揭示關聯位點的等位變異等，將為豇豆的分子育種和遺傳改良提供分子水平依據。

試驗從83個豇豆種質材料中共篩選出豇豆全基因組分布的156個多態性SSR標記，揭示了供試豇豆群體具有中等偏下的遺傳多樣性水平。而且對豇豆種質材料進行群體遺傳結構分析后，發現其中存在一定的遺傳分化，可將83個豇豆種質材料劃分為2個亞群結構，推測可能是由于所選樣品多為人工選育的后果，在長期的人工選擇作用下，豇豆出現了遺傳分化、各種質材料的遺傳背景趨于狹窄、遺傳多樣性偏低造成的。因此，加大力度開展豇豆種質資源及其野生資源的收集，充實和豐富豇豆基因庫資源，是今后豇豆種質資源與遺傳育種研究所需要努力的重點方向。

豇豆的產量性狀是一類復雜的數量性狀，容易受到環境影響。因此試驗選取不同地點進行田間種植，進行了連續兩年三季的觀測。分析發現，單株結莢數（變異系數79.98%）和鮮莢單莢重（變異系數71.74%）受環境影響相對比較大，而干種子長/寬（變異系數7.69%）則受環境影響相對較小。由此可見，在開展豇豆產量性狀的分子輔助育種中，要考慮地區生態環境的差異對單株結莢數和鮮莢單莢重等產量性狀的影響，借鑒當地環境下的豇豆產量性狀相關基因或者QTL位點，對于育種而言是十分重要的。

目前，科技工作者已經發現了一批豇豆產量相關性狀的QTL位點，包括豇豆子粒大小和鮮豆莢大小[20]、莢長[12]、始花期、始花節位、單株結莢數[21]、盛花時間[22]等相關QTL位點。但由于遺傳背景、構圖群體和生長環境的差異影響，只能反映出少量雜交組合中產量相關性狀的遺傳信息，局限性還比較明顯。

與上述研究結果不同，本試驗在豇豆群體水平上，通過SSR分子標記與豇豆產量相關性狀的關聯分析，發掘出一批與產量性狀顯著關聯的SSR標記位點，揭示了豇豆基因組中產量性狀的遺傳位點分布特點。這些與表型性狀關聯的SSR標記在豇豆基因組上的分布不均，主要分布在連鎖群LG2、LG3、LG4、LG7、LG11上，其SSR分子標記對關聯性狀的表型變異解釋率范圍在9%～33%，解釋率越高說明關聯程度越大；其中，千粒重的解釋率最低（9%），鮮莢單莢重的解釋率最高（33%）。進一步分析發現，同一個性狀有多個SSR標記與之相關聯，包括葉寬有2個SSR標記與之關聯（標記位點CLM0251和CLM0850），鮮莢單莢重有3個SSR標記與之關聯（標記位點CLM0347、CLM0251、CLM0614）；同一個標記也可有多個性狀相關聯，例如，標記位點CLM0251與葉寬、鮮莢單莢重均有關聯。這可能是性狀相關基因多效應的遺傳基礎。

總之，試驗采用SSR分子標記在豇豆中開展了全基因組關聯分析研究，發掘出一批與豇豆產量性狀關聯的SSR分子標記，這將為在豇豆育種中開展關聯分析與分子標記輔助育種等研究提供借鑒。

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