美味牛肝菌液態發酵菌醋的研制

呂紅英

摘要：通過單因素試驗和正交試驗，確定美味牛肝菌（Boletus edulis）菌絲體液態發酵的優化條件，利用其發酵液研制出美味牛肝菌液態菌醋。結果表明，美味牛肝菌液態發酵的最佳培養基為： 葡萄糖20.0 g、酵母浸出膏5.0 g、KH2PO4 3.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g、VB1 0.01 mg；最佳發酵條件為：pH 5.0、裝液量90 mL、培養溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養時間6 d。美味牛肝菌液態菌醋的最優配方為：發酵液50%、檸檬酸0.20%、穩定劑0.18%、甜味劑0.15%。

關鍵詞：美味牛肝菌（Boletus edulis）；液態發酵；醋

中圖分類號：S646.3；TS264.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2015）16-4026-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.050

The Preparation of the Liquid Fermentation Vinegar of Boletus edulis

LV Hong-ying

（College of Bioengineering， Jilin Agricultural Science and Technology College， Jilin 132101，Jilin， China）

Abstract：Optimize the conditions of liquid fermentation for mycelium of Boletus edulis by single factor test and orthogonal test. Developed using fermented liquid porcini of B. eduli. The results showed that： the optimal conditions of liquid fermentation of B. edulis： Glucose20.0 g， yeast extract 5.0 g， KH2PO4 3.0 g，MgSO·7H2O1.5 g， VB1 0.01 mg.The optimum culture conditions were： the value of pH was 5.0， the volume of liquid 90 mL ， culture temperature of 26 ℃， the oscillation velocity 180 r/min， cultiva tiontime 6 d. The optimal formula for liquid vinegar bacteria of B. edulis was： fermentation liquid 50%， citric acid 0.20%， stabilizer 0.18%， sweetener 0.15%.

Key words：Boletus edulis； liquid fermentation； vinegar

釀造醋不僅含有豐富的營養成分還具有天然、營養、保健等特性[1]。中國民間也流傳著許多以食醋為主或為輔治療疾病的藥方[2]。食醋不僅有抗菌、緩解疲勞、降血脂、降低血清中的膽固醇含量、預防和治療糖尿病等功效，而且還有抗氧化、抗衰老、美容、解酒保肝等作用[3，4]。

食用菌是能夠形成大型肉質或膠質的子實體或菌核類組織，并能供人們食用或藥用的一類大型真菌[5]，不僅味道鮮美，營養豐富，而且富含蛋白質、脂肪、多糖、維生素、抗生素、核苷酸等物質，能調節人體新陳代謝，增強體質，被譽為“人類植物性食品營養的頂峰”[6]，是深受大眾喜愛的健康食品。為了豐富食品種類，提高食品營養價值和保健功能，可以將食用菌應用到食品工業中，其中食用菌發酵菌醋就是一種有效的途徑。美味牛肝菌（Boletus edulis）又名大腳菇，屬于擔子菌亞門層菌綱傘菌目牛肝菌科中的一種[7]，是一種世界范圍內分布的食藥兼用經濟價值較高的真菌，中國各省均有分布，尤其西南地區產量較高[8]，且全世界已知的牛肝菌屬已有1 024種，中國已知的可食用的就有199種[9]。美味牛肝菌的肉質肥厚而細嫩、香味濃郁、味道鮮美、營養豐富、風味獨特，美味牛肝菌含有多種生物堿可治腰腿疼痛、手足麻木、盤骨不舒、四肢抽搐以及婦女白帶異常等癥[9，10]，具有一定的營養價值和藥用價值。經常食用牛肝菌可明顯增強機體免疫力、改善機體微循環。本試驗旨在利用美味牛肝菌的營養功效研發液態發酵菌醋的生產工藝，拓寬其利用范疇。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種：美味牛肝菌，釀酒干酵母，醋酸菌。

儀器：電子天平、真空抽濾裝置、恒溫搖床、恒溫培養箱、高壓滅菌鍋、超凈工作臺、手持糖量計等。

1.2 工藝流程

1.3 方法

1.3.1 菌種活化 將美味牛肝菌種用接種針接到斜面培養基中，于25 ℃活化培養5 d，待菌絲體長滿斜面[5]，備用。

1.3.2 液體種子培養 將活化的美味牛肝菌用接種針從斜面接入到液體種子培養基中，培養溫度28 ℃，150 r/min搖瓶培養3 d。

1.3.3 液體發酵培養 將種子培養液按10%接種量接種于發酵培養基，28 ℃，150 r/min振蕩培養6 d后得到發酵液。

1.3.4 菌絲體生物量測重方法 用雙層紗布過濾即分離得到菌絲體和發酵液，發酵液備用，將菌絲體用去離子水沖洗3次再用濾紙吸至不滴水，用電子天平稱重。

1.3.5 補料 向上述美味牛肝菌發酵液中補充已滅菌的20%蔗糖溶液，將其可溶性固形物含量調整為9%～10%。

1.3.6 酒精發酵、醋酸發酵 將補料后的美味牛肝菌發酵液100 mL裝入250 mL三角瓶中，接入預先活化好的酵母菌，接種量10%，均勻攪拌，置于30 ℃恒溫培養箱中培養3～4 d，待酒精含量達到5%～6%時停止酒精發酵。向酒精發酵后的成熟的酒醪中接入醋酸菌培養液，在28～32 ℃下進行醋酸發酵，醋酸發酵過程中每日攪拌2～3次，并隨時檢測發酵液中醋酸和酒精的含量變化。當酸度不再增加，酒精含量達到最小即到達醋酸發酵終點。

1.3.7 加鹽淋醋、澄清過濾 醋醅成熟后及時加入8%～10%食鹽抑制醋酸菌的活性，防止成熟醋醅發生過度氧化，降低醋酸產量。先將一半食鹽放入醋醅上拌勻，另一半食鹽撒在醋醅表面，第二天翻醅1次，接著再翻醅，1～2 d即可進行淋醋，采用套淋法循環泡淋。然后將上述發酵液用4層紗布進行粗濾之后加入殼聚糖澄清，用真空泵進行抽濾， 即得澄清透明的美味牛肝菌醋原液。

1.3.8 調配 量取飲用水和蜂蜜（作為風味成分，添加量4%，添加過多會增加成品飲料中糖的含量），然后對發酵液量、調味劑、穩定劑、檸檬酸等進行單因素試驗，確定單因素對產品品質的影響，然后進行正交試驗，以期獲得最佳配方工藝[11-14]。

1.3.9 裝瓶、滅菌、陳釀、成品檢驗 定量裝瓶封蓋，裝瓶后，立即用巴氏消毒法進行滅菌，密封陳釀20～30 d左右，即得成品美味牛肝菌保健醋。對產品進行感官檢驗[15]、理化檢驗、微生物檢驗，各項指標都符合飲料行業相關標準即為成品。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基的篩選

2.1.1 碳源對菌絲生長的影響 以蛋白胨2.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg為單因子基礎培養基[16]，分別以20.0 g的葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、山梨醇和可溶性淀粉作碳源試驗，以基礎培養基為空白對照，確定對美味牛肝菌菌絲生長影響的最優碳源。圖1結果表明，美味牛肝菌對試驗中所用碳源均可利用，既能利用成分復雜的復合碳源，也能利用單糖和雙糖等小分子碳源，所試碳源中以葡萄糖最好，菌絲體生物量達121 g/L，菌絲生長快，菌絲球小，均勻，密度高。所以綜合不同碳源對美味牛肝菌菌絲生長的影響，以葡萄糖為最適碳源。

2.1.2 氮源對菌絲生長的影響 以葡萄糖20.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg為基礎培養基，分別以5.0 g的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出膏、硫酸鎂、麩皮和水解乳蛋白作氮源試驗，以基礎培養基為空白對照，測定不同氮源對美味牛肝菌菌絲生長的影響。圖2結果表明，在不同的氮源培養基中菌絲體生物量有所不同。其中以酵母浸出膏作為氮源時，菌絲生物量最高，并且菌絲球大小均勻。所以綜合不同氮源對美味牛肝菌菌絲生長的影響，以酵母浸出膏為最適氮源。

根據上述試驗結果表明，確定最適發酵培養基組成為：葡萄糖20.0 g，酵母浸出膏5.0 g，KH2PO4 3.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，VB1 0.01 mg。

2.2 發酵條件的選擇

2.2.1 培養溫度對菌絲生長的影響 將接種搖瓶分別置于18、22、26、30 ℃ 180 r/min振蕩培養6 d后，測定培養溫度對美味牛肝菌絲生長的影響（表1）。結果表明，溫度對美味牛肝菌的生長十分重要，在受試的18～30 ℃菌絲均能生長。但是在較低溫度和較高溫度下菌絲生長都不是很好，只有在26 ℃菌絲最好，菌絲體生物量高，且合適的溫度能縮短發酵時間。因此，菌絲生長的最適培養溫度為26 ℃。

2.2.2 培養時間對菌絲生長的影響 250 mL三角瓶裝入90 mL培養液，26 ℃、180 r/min振蕩培養，測定不同培養時間對美味牛肝菌絲生長的影響（表2）。由表2可知，隨著發酵時間的延長，菌絲體含量逐漸增加，但發酵前期菌絲體生物量增加迅速，第五天出現了大量菌絲球，發酵液變得透明，第六天菌絲體生物量達到較大值。從第七天再繼續培養，雖然菌絲體也在增加，但菌絲體生物量增加幅度相對緩慢。而隨著發酵周期的延長，生產成本增加幅度較大，因此，綜合產品質量因素及經濟因素，菌絲生長的最適發酵周期確定為6 d。

2.2.3 pH對菌絲體生長的影響 將培養液pH分別調為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0，接斜面菌種1.0 cm2、26 ℃、180 r/min振蕩培養6 d后，測定pH對美味牛肝菌絲生長的影響（表3）。由表3可知，美味牛肝菌在偏酸的環境下生長較好，菌絲體生物量比較高，且該pH與培養基的自然pH 5.0相近。綜合培養基初始pH對菌絲生長的影響，美味牛肝菌絲生長的最適pH為5.0～5.5。

2.2.4 振蕩速度對菌絲生長的影響 250 mL三角瓶于26 ℃條件下分別處于90、120、150、180、210 r/min振蕩速度培養6 d后，測定振蕩速度對美味牛肝菌絲生長的影響（表4）。由表4可知，食用菌液體搖瓶培養的菌絲生物量顯著優于固體培養基或液體靜置培養基，在一定范圍內，隨著轉速的增大，通氣量增大，菌絲球數量增多，有利于菌絲的生長；在轉速達到180 r/min時菌絲生物量最大，但當轉速達到210 r/min時，菌絲生長開始下降，因此，美味牛肝菌絲生長的最適振蕩速度為180 r/min。

2.2.5 裝液量對菌絲生長的影響 250 mL的三角瓶中分別選擇50、60、70、80、90、100、110、120 mL裝液量，26 ℃、180 r/min振蕩培養6 d后，測定裝液量對美味牛肝菌絲生長的影響（表5）。由表5可知，菌絲體生物量與裝液量呈正相關，隨著裝液量的增加，菌絲體生物量也增多；裝液量少，菌絲體生物量也少，培養基利用率也不高，但裝液量超過90 mL時，由于搖瓶供氧不足，菌絲生物量的增加幅度降低。因此，美味牛肝菌絲生長的最適裝液量確定為90 mL。

2.3 發酵條件綜合試驗

通過發酵過程中培養基pH、振蕩速度、培養溫度、裝液量及培養時間5個因素，設計3個水平進行試驗， 以菌絲體干重為參考指標，確定最優發酵條件（表6）。由表6的極差R的大小可知，A>D>C>B>E即各因子重要性的順序為：pH>裝液量>培養溫度>轉速>培養時間，發酵的最優搭配組合為A2B2C3D3E2，即pH 5.0、裝液量90 mL、培養溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養時間6 d來進行發酵試驗，有利于美味牛肝菌在發酵罐中產生大量的菌絲體，且發酵液香味清純。

2.4 菌醋配方的設計

2.4.1 發酵液對產品品質的影響 采用檸檬酸的添加量為0.2%、穩定劑（黃原膠）的添加量為0.2%、甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎上分別加入30%、40%、50%、60%、70%的發酵液配制飲料（表7）。由表7可知，當發酵液的添加量從30%增加到50%時，產品品質越來越好。當發酵液的添加量繼續增加，發酵液對發酵飲料的品質影響較小，甚至停止。

2.4.2 甜味劑的選用及用量 甜菊糖苷作為一種常用的甜味劑，其用量直接影響著發酵飲料的風味，需要嚴格控制用量，是調配過程中應特別注意的步驟。在發酵液的添加量為50%，檸檬酸的添加量為0.2%，穩定劑（黃原膠）的添加量為0.2%的基礎上分別加入0.01%、0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的甜菊糖苷配制飲料。由表8可知，甜菊糖苷的添加量在0.05%～0.15%時品質較好，比較合適大眾口味。

2.4.3 檸檬酸對產品品質的影響 在發酵液的添加量為50%，穩定劑（黃原膠）的添加量為0.2%，甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎上分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的檸檬酸配制飲料。由表9可知，當檸檬酸的添加量為0.2%時發酵飲料的感官品質最好，當其量超過0.2%后，發酵飲料的酸味越來越大，從而影響產品品質。

2.4.4 穩定劑的選擇 通過前期試驗對黃原膠、果膠、明膠、CMC等穩定劑進行對比選擇試驗后，確定黃原膠穩定效果最好，需對黃原膠的用量進一步確定。在發酵液的添加量為50%，檸檬酸的添加量為0.2%，甜味劑（甜菊糖苷）的添加量為0.05%～0.15%的基礎上分別加入0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的穩定劑（黃原膠）配制飲料。由表10可知，當穩定劑的添加量達到0.2%時，發酵飲料的感官品質最好，且不會出現沉淀，而超過0.2%后穩定劑會使發酵飲料中的可溶性固形物產生沉淀，從而影響感官品質。

2.5 發酵飲料配方的綜合試驗

在單因素試驗的基礎上，選取最優的3個水平，按L9（34）正交試驗設計最佳配方。正交試驗因素水平見表11，試驗結果見表12。由表12可知，A>D>C>B，即發酵液對發酵飲料品質的影響顯著，檸檬酸、穩定劑、甜味劑對發酵飲料品質的影響均不顯著，因素影響主次順序為發酵液>穩定劑>檸檬酸>甜味劑，試驗時可選取最佳水平為A2B3C2D2，即發酵液50%、檸檬酸0.20%、穩定劑0.18%、甜味劑0.15%時，感官評分最高，發酵飲料品質最好。

3 結論

以美味牛肝菌為研究對象，從菌種的活化、培養、發酵及發酵飲料配方的設計等方面進行研究。先對發酵培養基的篩選進行單因素試驗，得出最適碳源為葡萄糖，最適氮源為酵母浸出膏，然后對發酵條件的選擇進行正交試驗，得出最佳發酵條件為：pH 5.0、裝液量90 mL、培養溫度26 ℃、振蕩速度180 r/min、培養時間6 d，最后進行發酵飲料配方的正交試驗得到發酵飲料的最優配方為：發酵液50%、檸檬酸0.20%、穩定劑0.18%、甜味劑0.15%。試驗采用食用菌液態發酵的方法，制得更加優化的發酵液，并對其發酵液進行食品開發，經后期調配降低酸度，并添加甜味物質制成的美味牛肝菌保健醋飲料，風味獨特， 酸甜可口， 富含多種生物活性物質， 具有十分廣闊的市場前景。

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