柔肝通絡湯預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護作用*

龍華君　周慎　伍大華　劉雨　唐燕

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南長沙410006；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410007）

·研究報告·

柔肝通絡湯預處理對腦缺血再灌注損傷大鼠腦保護作用*

龍華君1周慎1伍大華1劉雨2唐燕2

（1.湖南省中醫藥研究院附屬醫院，湖南長沙410006；2.湖南中醫藥大學，湖南長沙410007）

目的觀察柔肝通絡湯對大鼠腦缺血再灌注損傷的影響。方法將SD大鼠分為柔肝通絡湯高、中、低劑量組和空白對照組、假手術組、模型組。采用線栓法復制大鼠局灶性腦缺血/再灌注損傷（MCAO）模型，分別觀察缺血再灌注后3、6、12、24、48 h神經學評分及再灌24 h腦梗死面積。結果柔肝通絡湯能夠明顯改善模型動物的神經病學癥狀，縮小腦梗死面積。柔肝通絡湯各劑量組的神經功能缺損評分及梗死灶面積均低于模型組（P＜0.05）。結論柔肝通絡湯在防治大鼠腦缺血再灌注損傷方面具有腦保護作用。

柔肝通絡湯腦缺血再灌注腦梗死面積神經功能評分

腦血管疾病是導致全球人口死亡的三大疾病之一，嚴重危害人類健康。腦缺血再灌注損傷是指腦缺血恢復血液灌注后，腦細胞損傷反而進行性加重。柔肝通絡湯是基于中風腎虛血瘀病機，以益腎生髓、活血通絡立法而創制的方劑，從肝腎治腦，腎腦同治，在治療腦缺血再灌注損傷方面療效顯著［1-2］。本研究探討了柔肝通絡湯對大鼠腦缺血再灌注損傷中神經功能的保護作用?，F報告如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠176只，體質量為250～300 g，鼠齡為18月。由湖南中醫藥大學實驗動物部提供。

1.2藥物柔肝通絡湯由制何首烏15 g，桑椹15 g，枸杞子30 g，丹參30 g，葛根30 g，當歸尾10 g，赤芍10 g，地龍10 g，山楂15 g組成。藥材購自湖南省中醫藥研究院附屬醫院，經鑒定為道地藥材。一煎加水500 mL，煎汁150 mL；二煎加水300 mL，煎汁150 mL；取2次煎汁混合，文火煎，成膏狀（含生藥2 g/mL），冷藏備用。

1.3試劑與儀器紅四氮唑（TTC）：購自上海鈺博生物科技有限公司。水合氯醛：分析純，購自天津市科密歐化學試劑開發中心。恒溫水?。汉现嗅t藥大學免疫組化教研室提供。

1.4分組及給藥將176只大鼠先按體質量大小分層，再采用隨機數字表法隨機分成6組，其中空白對照組16只，假手術組16只，模型對照組36只，柔肝通絡湯低、中、高劑量組各36只。假手術及空白組取2只大鼠、模型組及柔肝通絡湯組取6只大鼠用于再灌注24 h的TTC染色。以50 kg成人每日服用柔肝通絡湯劑（生藥材含量165 g）為劑量參照標準進行換算［3］，柔肝通絡湯低、中、高劑量組每日灌胃柔肝通絡湯劑分別為7、14、28g/kg生藥含量，相當于50kg人等效劑量的0.5倍、1倍、2倍。藥物質量濃度均按大鼠1.4 mL/100 g灌胃容量用蒸餾水配制?？瞻讓φ战M、假手術組與模型組灌胃0.9%氯化鈉注射液1.4 mL/100 g。每日1次，連續7 d，最后1次于術前30 min給予。

1.5模型制備采用改良Longa［4］法制作大鼠大腦中動脈堵塞（MACO）模型，假手術組栓線插入深度在15 mm以內，此深度不足以阻斷大腦中動脈，其余步驟與模型組相同。術中室溫保持在25～30℃，100 W白熾燈照明維持肛溫（37.5±0.5）℃。術后消毒皮膚單籠飼養觀察，自由飲食。

1.6標本采集與檢測1）神經學評分：缺血再灌注動物模型蘇醒后，在再灌注3、6、12、24、48 h時間點，按照Longa［4］神經功能缺損評分法進行評分：無神經損傷癥狀為0分；不能完全伸展對側前爪為1分；向對側轉圈為2分；向對側傾倒3分；不能自發行走，意識喪失為4分。2）TTC染色及腦梗死面積的測定：缺血2 h再灌注24 h時，各組大鼠用10%水合氧醛（0.35 mL/ 100 g）腹腔注射深度麻醉后固定大鼠，暴露心臟。鉗夾住腹主動脈及下腔靜脈，用磨鈍的10號針頭刺入左心室，先快速滴入0.9%氯化鈉注射液約100 mL，后斷頭取腦，腦組織置于-20℃冰箱約15 min后，去除嗅球、小腦和低位腦干。每個腦組織切成5個連續冠狀切片（片厚2 mm），迅速置于1%TTC染液中，37℃避光水浴15 min，每間隔5 min將切片翻動1次。染色后的正常組織為玫瑰紅色，梗死組織為白色。將每組腦片排列整齊，拍照保存，應用圖像分析軟件統計分析，計算腦梗死面積百分比。

1.7統計學處理采用SPSS17.0統計軟件處理。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異統計學意義。

2　結果

表1　各組大鼠各時間點神經功能缺損評分比較（±s）

表1　各組大鼠各時間點神經功能缺損評分比較（±s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與假手術組比較，△P＜0.01。下同。

組別n空白對照組10假手術組10模型組30再灌注24h時再灌注48h時0 0 0 0 2.83±0.41△2.67±0.82△柔肝通絡湯高劑量組301.17±0.41*1.33±0.52*1.50±0.55*2.00±0.63*1.67±0.82*柔肝通絡湯中劑量組301.33±0.52*1.50±0.552.00±1.102.33±0.821.67±0.52*柔肝通絡湯低劑量組301.33±0.84*1.83±0.752.17±0.412.50±0.552.33±1.03再灌注3h時再灌注6h時再灌注12h時000 000 2.00±0.63△2.17±0.75△2.33±0.82△

2.1各組大鼠神經功能缺損評分比較見表1。模型組與柔肝通絡湯高、中、低劑量組大鼠均出現神經功能障礙，假手術組及空白組大鼠未見明顯神經學功能損傷。再灌注24 h各組神經功能缺損評分最高，神經功能受損最嚴重，再灌注48 h時神經功能缺損評分開始降低。與假手術組比較，模型組各時間點大鼠均表現出嚴重的神經缺損癥狀（P＜0.01）。與模型組相比，柔肝通絡湯高劑量組各時間點神經功能得到了顯著改善（P＜0.05），柔肝通絡湯中劑量組在再灌注3 h和再灌注48 h神經功能改善作用最好（P＜0.05），柔肝通絡湯低劑量組在再灌注3 h時顯著改善神經功能（P＜0.05）。2.2各組大鼠腦梗死面積比較見表2，圖1。TTC染色結果顯示：梗死區主要位于大腦中動脈供血的額頂葉、基底節區等部位。應用圖像分析軟件統計分析，計算腦梗死面積百分比，發現除空白對照組與假手術組外，各組均呈大小不同的梗死灶。柔肝通絡湯低、中、高劑量能顯著減少梗死面積，與模型組相比，柔肝通絡湯各劑量組差異均有統計學意義（P＜0.05或P＜0.01）。

表2　各組大鼠再灌24 h時腦梗死面積比較（±s）

表2　各組大鼠再灌24 h時腦梗死面積比較（±s）

與空白對照組比較，▲P＜0.01。

組別n空白對照組2假手術組2模型組6腦梗死面積（%）00 25.13±2.18△柔肝通絡湯高劑量組613.66±4.53**柔肝通絡湯中劑量組614.76±3.47**柔肝通絡湯低劑量組621.25±1.42*

圖1　各組大鼠腦梗死面積比較

3　討論

缺血性腦卒中占全部腦卒中的60%～80%［5］，腦血管病的預防和治療已經成為國內外醫學工作者和醫學研究的重要課題。雖然中醫藥在降低缺血性腦卒中的致殘率、恢復神經功能方面雖有較好的療效，但對運動、感覺及語言等多項神經功能損傷的恢復差異較大［6-8］。探求恢復受損神經功能的方法和藥物是最為理想化的治療。

近年來的研究認為，缺血中風的病理基礎是：虛、風、熱、痰、瘀、毒［9］?？偠灾?，無非虛實二端，中風之虛主要責之于肝腎陰虛，中風之實主要歸咎于瘀血［10］。雖然中風病位在腦髓血脈，但實質上與肝、腎等臟腑有聯系，肝腎虧虛是中風病的基本病機。肝腎同源，補肝即補腎，而腎為先天之本，即是補腎法治療中風病的理論依據。髓海有病，其本在腎，所以治腎亦即治腦［11］。故腎虛血瘀是缺血性中風發病的重要的病理機制之一。有研究表明，補腎方藥有顯著的腦細胞保護作用，該方以補腎培元立法，佐以活血、化痰、通絡、泄毒之品，可以促進急性期患者神經功能的恢復，尤其對起病即有虛證表現的患者效果更加明顯［12-13］。故治療缺血中風在活血化瘀的同時，要補肝生血，補腎生髓，標本兼顧，使精髓旺，血絡活，瘀血散，神竅通。根據肝腎同源、從腎治腦、腎腦同治理論遣藥組方而成的柔肝通絡湯經臨床應用證實可明顯改善腦卒中患者的神經功能，提高臨床療效，降低致殘率，提高生活質量［1-2］。方中制首烏、桑椹、枸杞子滋補肝腎之陰，丹參、當歸尾、赤芍活血化瘀，葛根、地龍逐瘀通絡，山楂逐瘀化痰，全方共奏益腎生髓、活血通絡之功效。

本研究結果顯示柔肝通絡湯高、中、低量組均能降低神經功能評分，縮小腦梗死面積。筆者發現，在改善腦缺血再灌注后各時間點的神經功能損傷以及縮小腦梗死面積方面，柔肝通絡湯高劑量組效果最為顯著，提示柔肝通絡湯具有對抗腦缺血再灌注損傷的作用，形成腦保護。該方雖在臨床取得滿意的療效，實驗研究也表明其能有效減少腦缺血再灌注大鼠模型腦梗死面積和神經功能缺損癥狀，但該方通過何種機制形成腦保護還待進一步研究。

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The Effect of Rougan Tongluo Decoction Pretreated on the MCAO Model of Rats

LONG Huajun，ZHOU Shen，WU Dahua，et al.Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine Research Institute in Hunan Province，Hunan，Changsha 410006，China

Objective：To investigate the effect of Rougan Tongluo Decoction on cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.Methods：The experimental rats were divided into high，medium and low dose group and blank control，sham operation group and model group.The Focal cerebral ischemia/reperfusion injury（MCAO）model in rats was made by using suture-occluded method to observe Neurological score at 6h，12h，3h，24h，48h and Cerebral infarct size at 24 h after ischemia reperfusion.Results：Rougan Tongluo Decoction can obviously improve the animal models of neurological symptoms and Reduce infarction area.The Rougan Tongluo Decoction group's neurological deficit score and infarct size were lower than model group（P＜0.05）.Conclusion：Rougan Tongluo Decoction has a protective effect on preventing cerebral ischemia/reperfusion injury in rats.

Rougan Tongluo Decoction；Cerebral ischemia/reperfusion；Cerebral infarct size；Neurological score

R285.5

A

1004-745X（2015）09-1520-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.09.005

2015-04-12）

湖南省中醫藥科研計劃項目（2013110）；湖南省科技計劃項目（2014SK3053）