己烯雌酚及代謝物在鯉體內的組織分布及藥物代謝動力學

徐英江 任傳博 孫 巖 薛敬林 田秀慧 劉慧慧 宮向紅

(1. 山東省海洋資源與環境研究院, 山東省海洋生態修復重點實驗室, 煙臺264006; 2. 煙臺山水海產有限公司, 煙臺 264006)

己烯雌酚(Diethylstilbestrol, DES)和雙烯雌酚(Dienestrol, DS)均是經由人工合成的非甾體類雌激素, 并且雙烯雌酚經實驗確證為己烯雌酚的代謝物[1—3], 己烯雌酚和雙烯雌酚均具有化學結構簡單、并且通過化學合成容易獲得、合成成本較低的特點[4,5]。在水產養殖中, 己烯雌酚的主要用途是作為添加劑加入魚類飼料中[6—9],刺激魚類正常新陳代謝, 增加魚體內氮停留, 提高魚體內氨基酸合成蛋白的速度, 最終達到促進魚類生長的目的[10,11]。其中殘留在魚體內的己烯雌酚和雙烯雌酚通過食物鏈進入人體, 破壞人體正常生理平衡, 兩種物質對人類的危害也被逐漸發現, 且己烯雌酚已被證實是一種致癌物質,在體內的長期蓄積必然嚴重危害人和動物的健康[12—15]。美國和歐盟已經明令禁止使用己烯雌酚。2002年, 我國農業部在第 193號公告中宣布停止己烯雌酚在所有食用動物中使用[16,17]; 并在第 235號公告中規定己烯雌酚在動物性食品中不得檢出[18], 但目前的相關法令和標準尚未制定雙烯雌酚的測定標準。

鯉作為我國重要的食用魚類, 因其營養豐富、經濟價值高深受消費者喜愛。本試驗采用口灌給藥的方法對常規養殖的鯉進行給藥, 進一步研究了兩種物質在鯉體內不同組織中的分布情況以及相關藥物代謝參數。本試驗可為己烯雌酚在其他水生生物體內的藥物代謝提供參考, 并且可以為水產養殖科學規范用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

乙腈、乙酸乙酯、甲醇、正己烷為色譜純, 所用水為超純水; 碳酸鈉為分析純, 鹽酸為優級純; 標準品己烯雌酚和標準品雙烯雌酚(純度 99.5%), 內標標準品 D8-己烯雌酚(純度 99.5%), 上述三種標準品均購自德國Dr. Ehrenstorfer公司; 低分子量肝素鈉注射液, 5000 IU,購自杭州九源基因工程有限公司。

1.2 儀器與設備

超高效液相色譜-串聯質譜儀(TSQ Vantage, Thermo,USA), 旋轉蒸發儀(Laborota 4001, Heidolph, Germany),氮吹儀(N-EVAPTM112, Organomation Associates, USA),超純水儀(Milli-Q Gradient, Millipore, France), 超聲波清洗器(KQ-600E, 江蘇, 昆山市超聲儀器有限公司), 高速離心機(TGL-10C, 上海, 安亭科學儀器廠), 微孔濾膜(0.22 μm, Millipore, France )。

1.3 試驗設計及采樣程序

試驗用鯉, 試驗進行前抽取樣品檢測體內不含分析物, 體重40—60 g, 富集試驗前暫養在長方形玻璃水槽(70 cm×40 cm×50 cm) 3d, 每天換水1次, 期間不喂食。試驗中挑選大小均勻、體重正常的鯉進行試驗。試驗過程中連續充氧, 保持水中溶解氧大于5.0 mg/L, 鯉存活率大于95%。選擇經過暫養的健康鯉, 隨機分為10個組, 每組約80尾。

準確稱量一定量的己烯雌酚標準品, 用冷卻的淀粉乳濁液溶解定容至試驗所需0.1、1.0和10.0 mg/kg bw 3個質量濃度, 加入少量食用色素, 使乳濁液呈現紅色。在整個試驗過程中, 記錄時間, 做好標簽。具體操作方法如下: 在1 mL的注射器上接上約5 cm長度左右的塑料軟管,吸取己烯雌酚后, 將軟管通到魚的胃部, 灌藥后若鯉沒有紅色液體吐出, 即可作為試驗用, 否則的話棄之不用。在整個試驗過程中每天記錄水溫以及鯉的死亡情況。

血液樣品的采集: 將適合試驗所用的鯉用抄網撈起,用干凈紗布擦干魚體后, 將1 mL注射器針頭插入鰓下心臟取血200—500 μL, 隨即放入離心管中(離心管事先要放入少量肝素鈉, 防止血凝固), 混合均勻后高速離心, 取上層血漿后, 置于–18℃條件下保存。肝胰臟和肌肉樣品的采集: 去除鯉的內臟、皮和骨骼等, 取肌肉部分攪碎,并裝入密封袋保存; 將整個肝胰臟取出, 裝入離心管備用。肌肉和肝胰臟均須置于–18℃保存, 測定前先將其在室溫條件下解凍, 然后再進行分析測定。

1.4 樣品前處理及凈化

樣品前處理及凈化方式參見文獻[19]。

1.5 超高效液相色譜-串聯質譜分析方法

色譜柱: Thermo C18(1.9 μm, 2.1 mm i.d.×100 mm);流動相: 甲醇和水; 流速: 0.25 mL/min; 進樣量: 10 μL;柱溫: 35℃。

電離方式: HESI-; 離子傳輸管溫度: 350℃; 氣化溫度: 350℃; 鞘氣壓力: 40 arb; 輔助氣流量: 10 arb; 噴霧電壓: 3000 V。己烯雌酚監測離子對: 267>222, 267>251;雙烯雌酚監測離子對: 265>93, 265>249; D8-己烯雌酚監測離子對: 275>259。

1.6 數據處理方法

試驗過程中對每個時間點進行分析測定, 并且取平行組的平均值, 采用DAS 2.0計算程序, 處理不同濃度口灌給藥后鯉體內的己烯雌酚和雙烯雌酚的含量-時間數據,并且計算出有關代謝參數。

2 結果與討論

2.1 己烯雌酚及雙烯雌酚的定量分析

配制質量濃度分別為5.0、10.0、25.0、50.0、100和200 ng/mL己烯雌酚及雙烯雌酚混標溶液, 流動相定容,內標法定量, 己烯雌酚標準曲線方程為y=0.00618764x–0.0171144, 相關系數R2=0.9994; 雙烯雌酚標準曲線方程為y=0.00732259x+0.0103639, 相關系數R2=0.9996。在空白鯉樣品中添加己烯雌酚標準溶液, 添加水平為0.5 μg/kg時, 信噪比(S/N)大于10, 表明己烯雌酚檢測下限(LOD)可達0.5 μg/kg; 同理雙烯雌酚定量下限(LOQ)可達1.0 μg/kg。

2.2 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉血漿中的分布和消除

在鯉口灌給藥后, 血漿中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時間曲線如圖 1所示。自一次口灌給藥后, 鯉體內己烯雌酚含量逐漸增大, 均在 2h達到最大值, 隨后己烯雌酚含量逐漸減少, 分別在10、12和12h降至檢出限以下, 在消除階段均出現前期消除速率快、后期消除速率相對減緩的趨勢, 平均消除速率分別 1.65、12.64和150.2 μg/(L×h)。在給藥后 0.25h檢測出雙烯雌酚, 給藥后2h達到最大濃度, 最大濃度分別為5.52、26.5和321 μg/L,并在8、12和12h降至檢出限以下, 消除速率趨勢與己烯雌酚一致, 其平均消除速率分別0.92、2.65和32.1 μg/(L×h)。

2.3 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肌肉中的分布和消除

圖1 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉血漿中的濃度-時間圖Fig.1 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in plasma versus time

圖2 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肌肉中的濃度-時間圖Fig. 2 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in muscle versus time

在鯉口灌給藥后, 肌肉中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時間曲線如圖2所示。肌肉中己烯雌酚含量逐漸增大, 均在10h達到最大濃度, 最大濃度值分別為25.4、395.6和7186 μg/kg; 隨后鯉體內己烯雌酚含量逐漸減少,上述3濃度分別在144、168和192h降至檢出限以下, 均出現前期消除速率快、后期消除速率相對減緩的趨勢; 至試驗24h, 己烯雌酚已降至9.52、 85.36和665 μg/kg, 僅為最高濃度的 37.5%、21.6%和 9.25%, 己烯雌酚平均消除速度分別 0.19、2.50和 39.5 μg/(kg×h)。數據表明在高濃度條件下, 己烯雌酚的平均消除速率明顯大于低濃度條件下的平均消除速率; 若減少相同百分比的濃度, 高濃度條件下所需的時間更短。雙烯雌酚與己烯雌酚變化趨勢相似, 分別在給藥后0.5、0.25和0.1h檢測出雙烯雌酚,給藥后10h達到最大濃度, 最大濃度值分別為5.02、30.2和280.6 μg/kg, 并在96、14和168h降至檢出限以下, 雙烯雌酚表現出與己烯雌酚一致的消除速率趨勢, 其平均消除速度分別 0.058、0.23 和 1.77 μg/(kg·h)。

2.4 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肝胰臟中的分布和消除

在鯉口灌給藥后, 肝胰臟中己烯雌酚及代謝物雙烯雌酚濃度-時間曲線如圖 3所示, 相比較己烯雌酚在血漿及肌肉中的分布和消除, 肝胰臟表現出明顯的富集能力。自一次口灌給藥后, 肝胰臟中己烯雌酚含量逐漸增大,上述 3濃度均在 8h達到最大值, 最大值分別為 157.9、1589和20000.8 μg/kg; 隨后鯉體內己烯雌酚含量逐漸減少, 上述3濃度分別在144、192和216h降至檢出限以下,均出現前期消除速率快、后期消除速率相對減緩的趨勢;至試驗24h, 己烯雌酚已降至25.2、 157.9和529.1 μg/kg,僅為最高濃度的 16.0%、9.94%和 2.65%, 己烯雌酚平均消除速度分別為 1.16、8.64和 96.2 μg/(kg×h)。數據表明在鯉的肝胰臟中, 高濃度條件下己烯雌酚的消除速率明顯大于低濃度條件下的消除速率; 若減少相同百分比濃度, 高濃度條件下所需的時間更短。雙烯雌酚與己烯雌酚變化趨勢相似, 均在給藥后 0.25h檢測出雙烯雌酚, 給藥后 8h達到最大濃度, 最大濃度分別為 29.7、358.6和5122.8 μg/kg, 并在96、168和192h降至檢出限以下, 消除速率趨勢與己烯雌酚一致, 其平均消除速度分別0.34、2.24 和 27.8 μg/(kg·h)。

圖3 口灌給藥后己烯雌酚及其代謝物雙烯雌酚在鯉肝胰臟中的濃度-時間圖Fig. 3 Content of Diethylstilbestrol and its metabolite Dienestrol in liver versus time

2.5 己烯雌酚在鯉血漿、肌肉和肝胰臟中的藥物代謝動力學參數

采用 DAS2.0藥物代謝動力學參數計算程序, 計算有關鯉藥物代謝動力學參數; 取其中一組己烯雌酚濃度-時間數據, 用對數圖進行初步判斷, 可見lgC與t呈雙指數函數特征, 初步判斷該藥在鯉體內不是一室模型, 可能為二室模型或三室模型; 相比較三室模型, 二室模型與所測數據有更好的擬合度, 因此本研究采用二室模型。結果見表1。

t1/2β(己烯雌酚的消除相半衰期)在血漿和肝胰臟中,隨著口灌給藥濃度的增大, t1/2β逐漸增大。但在肌肉中出現相反的規律, 可能是當肌肉體內己烯雌酚含量越高時,可以促進某種酶的生長, 而在這種酶的作用下, 己烯雌酚消除速率增大, 因此其消除相半衰期越短, 此結論有待進一步研究。

表1 口灌給藥后己烯雌酚在鯉血漿、肌肉和肝胰臟中的藥物代謝動力學參數Tab. 1 Pharmacokinetic parameters of Diethylstilbestrol in plasma, muscle and liver of Cyprinus carpio

AUC (己烯雌酚濃度-時間曲線下面積)以口灌給藥相當于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟中AUC 由高到低依次為: 肝胰臟[22913.795 μg/(kg×h)] >肌肉[6027.142 μg/(kg×h)]>血漿[577.111 μg/(L×h)]; 血漿、肌肉和肝胰臟中 AUC值相差很遠, 肝胰臟對己烯雌酚的吸收量約是肌肉吸收量的4倍和血漿吸收量的40倍, 說明己烯雌酚的蓄積能力因組織的不同有較大差別。

CL/F與 t1/2β都是衡量己烯雌酚在鯉各組織消除快慢的指標。以鯉血漿為例, 灌藥質量濃度越大, CL/F值越小,以口灌給藥相當于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟的 CL/F值依次為 1.591、0.166和 0.044 L/(h·kg), 在0.1 mg/kg bw和 10.0 mg/kg bw濃度組 CL/F值變化規律與1.0 mg/kg bw一致。

當口灌給藥后, 當達到 Cmax后, 其含量逐漸下降, 血漿中己烯雌酚濃度分別在8、10和10h下降了90%以上; 肌肉中己烯雌酚濃度分別在120、72和24h下降了90%以上;肝胰臟中己烯雌酚濃度分別在72、24和24h下降了90%以上; 如己烯雌酚在肝胰臟中消除 90%比肌肉中所用時間短, 但其濃度降至檢出限以下比肌肉所用時間長。

雙烯雌酚作為代謝物, 部分相關吸收參數無法使用軟件計算, 因此本研究僅借鑒使用了消除試驗部分的參數 t1/2β和 CL/F, 兩參數均可表明雙烯雌酚在鯉體內消除速率的快慢。以口灌給藥相當于1.0 mg/kg bw己烯雌酚為例, 血漿、肌肉和肝胰臟中t1/2β值分別為2.517、4.028和254.498h, 血漿、肌肉和肝臟中CL/F值分別為6.105、0.962和0.201 L/(h·kg), 說明各組織消除一半己烯雌酚所用時間血漿最短、肌肉次之, 肝臟最長。

2.6 己烯雌酚休藥期的規定

目前水產品殘留限量標準規定己烯雌酚不得檢出。從試驗結果看, 己烯雌酚在鯉的肝胰臟內消除所需要的時間最長, 因此本研究將鯉的肝胰臟作為代謝靶組織。在鯉口灌給藥后, 鯉肝胰臟內己烯雌酚和雙烯雌酚分別在6、8和9d后均降至檢出限以下, 因此基于本試驗條件, 將己烯雌酚在鯉體內的休藥期可定為6、8和9d。但在實際生產及養殖過程中, 一般多次重復給藥或者投喂含有己烯雌酚飼料, 并且會一直投喂直至停藥期滿、鯉起池為止。因此本試驗得出的休藥期比實際生產、養殖情況要短, 綜合考慮各方面的影響因素可適當延長己烯雌酚在鯉體內的休藥期。同時影響鯉代謝的影響因素有很多, 研究表明水溫的影響最大。在一定的溫度范圍內, 隨著水溫升高,己烯雌酚在鯉體內的代謝強度增強; 水溫降低, 其代謝強度將會減弱。文獻報道: 每當水溫升高 1℃, 藥物的代謝速度和消除速度一般情況下會提高 10%左右[20], 因此在實際養殖過程中, 應根據外界環境和養殖習慣適當縮短或延長藥物的休藥期。

3 結論

當鯉口灌給藥后, 在相同條件下, 鯉的肝胰臟中藥物濃度最大, 其次是肌肉, 血漿最小; 并且肝胰臟的平均消除速率、濃度最高值以相對于灌藥濃度的倍數均高于血漿和肌肉; 即使肝胰臟具有最大的藥物平均消除速率,但若將藥物消除至檢出限以下, 肝胰臟所需時間仍最長。根據相關動力學參數, 初步探討了己烯雌酚在鯉體內的休藥期。但試驗條件和實際生產過程存在一定差別, 應根據外界環境和養殖習慣適當縮短或延長藥物的休藥期,而不應該只單純規定一個休藥期, 最終達到保障消費者食用安全的目的。