金鈴子散抗炎有效部位篩選及質譜表征

戴 一，賈曉益，王海菲

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金鈴子散抗炎有效部位篩選及質譜表征

*戴 一，賈曉益，王海菲

（安徽新華學院藥學院，安徽，合肥 230088）

目的篩選金鈴子散的抗炎有效部位并對有效部位進行質譜(MS)表征。方法 將金鈴子散采用梯度極性溶劑石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，提取物通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗以確定抗炎有效部位，并對抗炎有效部位采用MS進行初步表征。結果 金鈴子散石油醚提取物對小鼠耳廓腫脹有明顯的抑制作用，MS分析其特征離子峰為m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4。結論 金鈴子散石油醚提取物具有明顯的抗炎作用，為金鈴子散的抗炎有效部位。

金鈴子散; 有效部位; 抗炎；質譜

炎癥是常見且重要的病理過程，體表外傷感染及器官病變如肝炎、腎炎、肺炎等都屬于炎癥性疾病，炎癥局部表現為紅、腫、熱、痛。治療炎癥的藥物有糖皮質激素類及非甾體抗炎藥物，盡管表現出了顯著的抗炎療效，但存在一定的副作用[1-2]，抗炎藥物有待進一步開發。金鈴子散出自《素問·病機氣宜保命集》，延胡索、金鈴子兩味藥為其組成成分，兩藥配伍比例為1:1，以延胡索活血行氣；川楝子泄肝火、疏肝行氣，二藥相配，一溫一寒，一血一氣，配伍后能活血散淤、行氣鎮痛，為治療胸痛、脘腹疼痛的常用藥方[3]。有研究報道延胡索乙素為延胡索的抗炎成分[4]，而金鈴子散藥效物質基礎研究并不深入，對于金鈴子散的研究主要集中在延胡索和金鈴子二味藥材的配伍比例，且抗炎的研究對象主要為金鈴子散的水提物[5-7]，目前尚未見其抗炎有效部位的研究報告。二甲苯致小鼠耳廓腫脹模型不需要特殊設備且快速，它是天然藥物抗炎藥研究中最常用的炎癥模型[8]。為了提高金鈴子散在傳統用藥中的療效，本研究將金鈴子散分別用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗，初步篩選抗炎有效部位；并對有效部位采用質譜(MS)進行分析，為科學開發金鈴子散的藥理作用提供可靠的實驗依據。

1 材料

1.1 動物

健康昆明種小鼠，雄性，體重20 ± 2 g，由安徽醫科大學實驗動物中心提供(合格證號：皖醫實動準字第01號)。在恒溫(22℃)，光照周期12 h: 12 h環境中飼養。

1.2 藥物與試劑

金鈴子散自制（川楝子、延胡索購于亳州藥材市場）；阿司匹林（湖北鴻運隆生物科技有限公司）；石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、二甲苯等均為分析純。

1.3 儀器

API3000質譜儀（美國應用生物系統公司），FA2004型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司），8510E-DTH超聲提取器（美國必能信公司），旋轉蒸發器RE-3000(上海亞榮生化儀器廠)，DZF-6020型真空干燥箱（上海三發科學儀器有限公司），打孔器。

2 方法

2.1 各極性段樣品的制備

稱取10 g金鈴子散，6份，分別用10倍量的石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取，每次提取30 min，每組溶劑提取3次，每組提取液合并，濃縮至干，稱重，以0.5%的CMC-Na及蒸餾水轉移至50 mL容量瓶備用。

2.2 分組及給藥

動物隨機分為8組，依次為：模型組、石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取組、阿司匹林組。金鈴子散：各組給藥劑量按照臨床公斤體重用藥量折算，小鼠每10 g體重給藥0.2 mL/d，含藥量相當于0.2 g生藥；阿司匹林對照組，小鼠給藥量(100 mg·kg-1)。

2.3 二甲苯誘導小鼠耳腫脹模型的制備與檢測

取昆明種小鼠80 只，體重18~22 g，雌雄各半，隨機分為8 組，每組10 只，即生理鹽水組、阿司匹林組、石油醚提取物組、四氯化碳提取物組、三氯甲烷提取物組、乙酸乙酯提取物組、甲醇提取物組及水提取物組編號，稱重，灌胃給藥，1 次/d，連續給藥4 d，生理鹽水組給生理鹽水20 mL /kg，阿司匹林組給阿司匹林，給藥量0.1 g /kg，給藥組按20 g /kg 灌胃給藥。給藥后1.5 h，將二甲苯0.05 mL均勻涂于小鼠右耳，30 min 后處死，用7 mm打孔器分別打下左右耳片，以左右耳重量之差作為腫脹度，計算腫脹抑制率，腫脹抑制率( %) =(對照組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度) /對照組平均腫脹度× 100%。比較給藥組與模型組之間小鼠耳片腫脹度的差異顯著性[7]。

2.4 統計處理

2.5 有效部位類別鑒定

對金鈴子散石油醚提取物進行質譜分析，質譜條件為：ESI正離子掃描模式，全掃描范圍M/Z 50-1000，NEB: 7.00、CUR: 8.00、IS: 5500.00、TEM: 350.00、DP 30.00、FP 200.00。

3 結果

3.1 金鈴子散各提取組分對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響

將金鈴子散分別用石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取的組分進行二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗，結果表明，金鈴子散石油醚、水、甲醇提取的組分均能抑制二甲苯誘導的小鼠耳腫脹，其中，石油醚超聲提取組與模型對照組相比，有顯著性差異（< 0.01），與阿司匹林陽性對照組對比無統計學意義。因此，確定石油醚超聲提取組分為金鈴子散抗炎有效部位。

表1 金鈴子散各提取組對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響(± s, n = 10)

Table 1 The results of the model of pinna swilling resulted by dimethyl benzenel with different extract fractions of Jinlingzisan

表1 金鈴子散各提取組對二甲苯誘導小鼠耳腫脹的影響(± s, n = 10)

分組劑量(g·kg-1)腫脹度(Δ mg)抑制率 (%) 模型組－9.77 ± 3.54－ 石油醚提取組202.12 ± 1.47**78.33 四氯化碳組206.43 ± 1.4631.13 三氯甲烷提取組207.32 ± 1.7725.09 乙酸乙酯提取組206.83 ± 3.6530.04 甲醇提取組204.78 ± 2.68*51.03 水提取組205.55 ± 2.96*43.14 阿司匹林組0.13.95 ± 2.51**59.56

與模型組比較*< 0.05,**< 0.01

3.2 有效部位質譜MS分析結果

抗炎實驗結果表明金鈴子散石油醚組分具有較強的抗炎作用，ESI-MS分析結果表明其抗炎有效部位主要主要在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.6、330.6、366.4具有較強的特征離子峰，參考文獻[9-11]，僅能對其中的4個峰進行歸屬m/z279.4與亞油酸分子離子峰一致、m/z301.6與高北美圣草素分子離子峰一致、m/z330.6與豆甾烷-3,5-二烯分子離子峰一致、m/z366.4與去氫紫堇堿分子離子峰一致。另外在m/z400以下，離子峰比較密集且強度不大，可能所含成分類型較多且含量不高，結合提取溶劑為石油醚，因此成分應屬于揮發油類[10]，其抗炎活性可能為多成分綜合作用結果，但其表現的質譜特征可作為金鈴子散抗炎有效部位的判斷依據，結果見圖1。

圖1 金鈴子散抗炎有效部位的質譜分析

4 討論與小結

金鈴子散由川楝子、延胡索二藥等量組成。本研究首次采用部分抗炎藥理實驗方法，將由石油醚、四氯化碳、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇及水超聲提取的金鈴子散不同組分通過二甲苯致小鼠耳廓腫脹實驗對金鈴子散的抗炎活性部位進行了篩選。實驗結果表明，金鈴子散石油醚超聲提取物對二甲苯所致的耳廓腫脹有抑制作用。說明抗炎活性部位主要在于極性較小的石油醚部位，該部分成分經ESI-MS直接進樣分析，在m/z102.1、149.2、205.3、279.4、301.5、366.4具有較強的特征離子峰，在m/z400以下離子峰較多，可見此類成分的復雜性，質譜峰顯示該有效部位中可能含有亞油酸、高北美圣草素、豆甾烷-3,5-二烯、去氫紫堇堿等，主要為一些揮發油成分，對于單個成分抗炎活性的研究未見報道，該有效部位的抗炎活性可能為多成分綜合作用的結果，對于單個成分的抗炎活性及各成分之間是否存在協同作用有待進一步研究。但質譜離子峰的特征為金鈴子散有效部位的判斷提供了依據，也為最大限度的開發金鈴子散的藥理作用提供了實驗依據。

參考文獻：

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ANTI-INFLAMMATORY ACTIVE FRACTION OF JINLINGZISAN AND ITS MS CHARACTERIZATION

*DAI Yi, JIA Xiao-yi, WANG Hai-fei

（School of Pharmaceutical Sciences of Anhui Xinhua College, Hefei, Anhui 230088,China）

Objective: To screen and characterize the anti-inflammatory effective fraction from Jinlingzisan. Methods: Jinlingzisan was ultrasonically extracted by petroleum ether, CCl4, CHCl3, ethyl acetate, methanol and water, respectively. The anti-inflammatory effective fraction was characterized by MS. Results: The petroleum ether extract of Jinlingzisan had the best anti-inflammatory effect and had ion peak of m/z 102.1, 149.2, 205.3, 279.4, 301.5 and 366.4.Conclusion: The effective fraction of anti-inflammatory from Jinlingzisan was petroleum ether extract.

Jinlingzisan; anti-inflammatory; effective fraction; MS

1674-8085(2015)01-0103-04

R284.1

A

10.3969/j.issn.1674-8085.2015.01.022

2014-08-17；修改日期：2014-12-12

安徽省教育廳自然科學研究項目（KJ2012Z136）

*戴 一(1979-)，男，安徽利辛人，講師，碩士，主要從事活性天然產物研究(E-mail:daiyiii@163.com);

賈曉益(1978-)，女，浙江金華人，講師，博士，主要從事抗炎藥物研究(E-mail:jiaxiaoyi78@126.com);

王海菲(1992-)，女，安徽安慶人，安徽新華學院藥學院2010級藥學專業本科生(E-mail:1476374614@qq.com).