幾株煙草根際促生細菌的揮發性物質對擬南芥根構型的影響

李敏,張鵬鵬,劉凱,邵蘭軍,姚良同,杜秉海,丁延芹*

1.廣東中煙工業有限責任公司,廣東廣州510000

2.青島明月藍海生物科技有限公司,山東青島266400

3.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室,山東泰安271018

幾株煙草根際促生細菌的揮發性物質對擬南芥根構型的影響

李敏1,張鵬鵬2,劉凱3,邵蘭軍1,姚良同3,杜秉海3,丁延芹3*

1.廣東中煙工業有限責任公司,廣東廣州510000

2.青島明月藍海生物科技有限公司,山東青島266400

3.山東農業大學生命科學學院/山東省農業微生物重點實驗室,山東泰安271018

為研究13株植物根際促生細菌（PGPR）產生的揮發性物質（VOCs）對擬南芥的生長促進作用，通過二分格培養法篩選出對擬南芥生長有影響的菌株，采用SPME-GC-MS對植物根際促生細菌產生的VOCs進行鑒定。結果表明，供試的13株植物根際促生細菌產生的VOCs能夠不同程度的促進擬南芥的生長、改變擬南芥的根構型。P1、MD8和FGH19菌株產生的揮發性物質對擬南芥的促生作用十分顯著，平均擬南芥鮮重達38.78、30.58、23.70 mg/株，分別比對照增加了5.71、4.29、3.10倍。DZQ8菌株處理的擬南芥PRL為8.03 cm，比對照處理增長了0.85倍,TZQ33和TZQ36菌株的處理對擬南芥LRN影響最為明顯，LRN分別為37.50和40.50，比對照處理分別增長了1.17和1.35倍，MTQ8、MD8、TZQ33和TZQ36菌株處理的擬南芥LRD分別為6.20、7.07、7.35和7.33 cm-1，比對照處理分別增大了0.55、0.77、0.84和0.83倍。因此，植物根際促生細菌產生的一些揮發性物質可以促進植物的生長、重塑根構型。通過對揮發性物質的分析及驗證，首次發現MTQ8產生的1,3-丁二醇對擬南芥植株有很明顯的促生作用，且確定1,3-丁二醇可以促進擬南芥的生長、調整根構型。

植物根際促生細菌(PGPR);揮發性物質(VOCs);促生作用;擬南芥

植物根際促生細菌（Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR）是指生活在植物根際的一類可促進植物生長、防治病害、增加作物產量的有益菌類[1-4]。大量研究表明，PGPR具有提供植物營養、促進植物根系發育、防治植物土傳病害的能力。產生揮發性物質是PGPR的促生機制之一，揭示PGPR具有促生作用的揮發性物質，不僅具有重要的理論價值，而且對于PGPR制劑的開發利用具有重要的實踐意義。

近年來，人們開始關注微生物產生的某些揮發性物質對植物的生防與促生作用。2002年，Schller等[5]采用氣相色譜-質譜聯用技術，首次分析了26種放線菌產生的揮發性物質（Volatile organic compounds，VOCs)。目前大量的研究集中于PGPR產生的一些VOCs對植物病原菌的抑制作用[6-10]。但對微生物產生的VOCs調節植物生長發育的報道較少。Ryu等[11]報道了枯草芽孢桿菌GB03和解淀粉芽孢桿菌IN937a產生的2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇能促進擬南芥的生長，表明VOCs可作為參與調節植物與微生物互作的信號分子。Farag等[12]采用頂空固相微萃取并結合交氣相色譜-質譜聯用的新技術，研究了枯草芽孢桿菌株GB03和解淀粉芽孢桿菌IN937a的VOCs 2,3-丁二醇和乙酰甲基原醇對擬南芥的促生作用。Kai等[13]報道不同種類的細菌能產生l-30種VOCs,而且大多數化合物是特有的。Francisca M等[14]研究了溫室條件下的檸檬土壤根際中的幾種芽孢桿菌屬的細菌對擬南芥根構型的影響，表明VOCs可以通過改變擬南芥根構型影響植物的生長。目前為止，大量PGPR菌株產生的VOCs對植物的促生作用尚不太清楚。本試驗以擬南芥作為模式植物，對13株不同屬種的植物根際促生細菌產生的揮發性物質進行促生試驗，研究這些菌株產生的揮發性物質對擬南芥根系生長發育及根構型的影響，并分析其所產生的揮發性化學組分，可望發現產生具有促生作用VOCs的新菌株和具有促生作用的新揮發性化合物。

1 材料與方法

1.1 供試菌株（表1）

表1 供試的植物根際促生細菌Table 1 Strains of plant growth promoting rhizobacteria tested in the study

1.2 植物材料和生長條件

選擇擬南芥(Arabidopsis thaliana)（野生型Col-0）作為模式植物進行研究。將擬南芥種子用70%的乙醇處理5 min，2.6%的次氯酸鈉處理10 min，無菌水沖洗7～8遍進行表面殺菌。將消毒后的擬南芥種子鋪在含有0.5×MS培養基的培養皿中。將培養皿豎直放置在光照培養箱中，使根能沿培養基表面不受到阻力的生長。光照培養箱的條件設置為白天16 h，黑夜8 h，光照強度H1，溫度22℃。

1.3 培養試驗

為了研究PGPR釋放的VOCs對擬南芥生長發育的影響，本試驗采用二分格培養皿進行培養。培養皿被分成兩部分，其中一部分是0.5×MS培養基，另一部分是PDA培養基。將培養了4 d的擬南芥移栽到含有0.5×MS培養基的一室中，每皿移栽五株。在另一室中加入20μL菌液，菌含量約為109CFU，每皿做四個平行。參見Francisca等[14]的培養方法將培養皿用封口膜封口豎直培養。10 d后，測擬南芥主根長度（PRL）、側根數目（LRN）、側根密度（LRD）和總生物量。

1.4 VOCs分析

將PGPR接種至含有20 mLPDA液體培養基的50 mL三角瓶中，用錫箔紙封口，在搖床中振蕩培養2 d，然后用蘭色的SPME萃取頭萃取產生的VOCs，進行氣相質譜分析。

1.5 統計分析

將擬南芥不同生長發育的參數用SPSS.v16.0軟件進行分析。

1.6 單一氣體對擬南芥的促生試驗

參照1.3方法，分別以1,3-丁二醇、2-甲基丁酸、2-庚酮、正戊醇、2,5-二甲基吡嗪、甲基壬基甲酮、癸醛和苯甲酸取代菌液，驗證其對擬南芥的促生作用。

2 結果

2.1 PGPR產生的揮發性物質促進擬南芥生長

試驗結果(圖1、2)表明，與對照相比，13個供試菌株中，除DZH3和DZQ8沒有明顯差異外，其它11個菌株產生的揮發性物質對擬南芥的生長均有不同程度的促進作用。其中P1菌株產生的揮發性物質對擬南芥的促生作用最為顯著，平均擬南芥鮮重達38.78 mg/株，比對照處理(5.78 mg/株)增加了5.71倍；MD8、FGH19、TZQ36、WCH1產生的揮發性物質對擬南芥的促生作用也十分顯著，平均擬南芥鮮重分別為30.58、23.70、22.03和16.80 mg/株，分別比對照增加了4.29、3.10、2.81和1.91倍。

圖1 部分菌株對擬南芥的促生效果Fig.1 Growth promotion of some strains on Arabidopsis thaliana

圖2 接種PGPR菌株對擬南芥的影響與空白對照的對比（LSD，P=0.05，n=20）Fig.2 Total fresh weight of Arabidopsis thaliana seedlings inoculated or not with PGPR strains（LSD,P=0.05,

2.2 PGPR產生的揮發性物質對擬南芥根構型的影響

13個PGPR菌株產生的揮發性物質對擬南芥根尖根毛發育有不同程度的影響(圖3）。DZH3和FGH19處理的擬南芥植株根尖根毛十分密集，WCH1處理的擬南芥植株根尖根毛長度增加明顯。

圖3 接種不同菌種對擬南芥根尖根毛的影響(放大倍數為10倍)Fig.3 Effect of different PGPR strains inoculation on Arabidopsis thaliana root hair of root tip(10 magnifications)

測定了PGPR菌株產生的揮發性物質對擬南芥的主根長度（PRL）、側根數目（LRN）和側根密度（LRD）的影響（圖4）。試驗結果表明，YQH58處理的擬南芥的PRL為3.68 cm比對照處理（4.33 cm)短一些，MD8、FGH19、DZH3和MTQ8處理的擬南芥PRL分別為4.58、4.45、4.05和3.88 cm與對照相比影響不大，差異不顯著，DZQ8菌株處理的擬南芥PRL為8.03 cm，與對照相比差異顯著，比對照處理增長了0.85倍；TZQ33和TZQ36菌株的處理對擬南芥LRN影響顯著，LRN分別為37.50和40.50，比對照處理（17.25）分別增長了1.17和1.35倍，YQH58和DZH3處理的擬南芥LRN分別為15.50和15.25，與對照相比，差異不顯著；MTQ8、MD8、TZQ33和TZQ36菌株處理的擬南芥LRD分別為6.20、7.07、7.35和7.33 cm-1，比對照處理（3.99 cm-1）分別增大了0.55、0.77、0.84和0.83倍，差異顯著，DZQ8菌株處理的擬南芥LRD為3.00 cm-1，比對照處理減小了0.25倍，DZH3、YQH58處理的擬南芥LRD分別為3.76、4.15和4.72 cm-1，DZH3比對照處理減小了0.06倍，YQH58和P1比對照處理分別增大了0.04和0.18倍，這三株菌產生的VOCs對LRD的影響相對較小。

圖4 不同菌株對擬南芥根構型的影響（LSD,P=0.05，n=20）A.主根長度、B.側根數目和C.側根密度Fig.4 Effect of different strains on Arabidopsis thaliana root developmental parameters（LSD,P=0.05，n=20）A.primary root length,B.lateral root number,C.lateral root density

2.3 PGPR產生的VOCs分析

通過SPME-GC-MS分析了13個PGPR菌株產生的揮發性物質。結果表明，大部分是醛類、酮類、醇類、酸類、酯類、烴類等化合物。TZQ36、WCH1和YQH58產生的揮發性物質大部分為酸類，其中酸類化合物分別占總化合物的62.66%、47.12%和49.55%。TZQ36產生的揮發性物質主要是3-甲基-丁酸（24.43%）和2-甲基-丁酸（38.23%），WCH1產生的揮發性物質主要是3-甲基-丁酸（20.17%）、2-甲基四氫噻吩-3酮（26.23%）和2-甲基-丁酸（26.95%），YQH58產生的揮發性物質主要是甲基糖醛酸（30.98%）。TZQ33、DZH3、YQH50、TZQ14和DZQ8產生的化合物大部分為酮類，其中測出的酮類化合物分別占總化合物的30.08%、28.26%、44.9%、56.91%和39.2%。TZQ33產生的揮發性物質主要是2-甲基四氫噻吩-3-酮（28.5%），DZH3產生的揮發性物質主要是3-甲基戊酮（9.26%）、2-癸酮（7.27%）和2-十二酮（4.25%）等酮類化合物，YQH50產生的揮發性物質主要是2-十一酮（21.66%），TZQ14產生的揮發性物質主要是4-壬酮（31.31%）和4-十一酮（13.68%），DZQ8產生的揮發性物質主要是3-甲基-2-戊酮（11.76%）和2-十九烷酮（9.95%）。TZQ2產生的化合物大部分為醛類，占總化合物的20.84%。主要為苯甲醛（17.92%）。FGH19產生的氣體大部分為醇類，占總化合物的29%。主要為3-甲基-1-丁醇（23.11%）。P1、MD8和MTQ8產生的氣體種類比較多，個別氣體結構比較復雜，很難分類討論。

2.4 單一揮發性化合物對擬南芥生長的的影響

為探索PGPR產生的具有植物促生作用的揮發性化合物，對檢測出的各菌株主要揮發性化合物進行了單一組分的促生試驗。結果表明，5～20μL/皿的1，3-丁二醇能促進擬南芥的生長，擬南芥的鮮重增加明顯，LRN和PRL也有不同程度增加；1～2μL/皿的2-庚酮處理的擬南芥LRN增多；1μL/皿的2,5-二甲基吡嗪處理的擬南芥鮮重、LRN和PRL均有所增加。加入2μL正戊醇，擬南芥苗就發黃，側根幾乎不長。加入2μL甲基壬基甲酮就造成擬南芥死亡。癸醛的致死率很高，加入0.5μL就造成擬南芥的死亡。2-甲基丁酸和苯甲酸對擬南芥的生長并沒有明顯的影響。

3 討論

植物根系是植物吸收營養物質和水分的主要器官，同時也是一些代謝物如細胞分裂素和激素的合成位點，因此植物根系對其生長和發育過程起著重要的作用。植物根系為了適應環境條件的變化在形態學和生理學方面顯示出了重要的可塑性。主根的發生雖然早在胚胎發育過程中就已經被決定，但是也會受到一些調控物質的影響，而會影響到植物在不同生長條件下生活的側根的發生與生長環境密切相關，受到植物激素的調控[15]，側根主要影響植物接觸營養和水分的面積，對農作物的生長極為重要[16]。目前已知調控側根發生和發育的植物激素主要是生長素，而且對生長素控制側根發育的路徑和分子機理的研究已經取得了顯著的進展[17,18]。

VOCs在生命王國里是一種有效的化學交流介質，它通常作為引誘劑、防腐劑或者警告信號。眾所周知，植物能夠向環境中釋放VOCs，同時它們也能檢測的到環境中的VOCs。植物產生的VOCs已經被證明做為它們自己特定物種的膜或者其他器官的交流信號。微生物菌株也可以釋放出VOCs用來交流、防御等目的。有一些VOCs可以刺激擬南芥根系中生長素的產生和運輸，使得側根增多，長度增加；還有一些VOCs對擬南芥有輕微的毒害作用，這種毒害作用很微小，反而刺激擬南芥改變了一些代謝途徑，誘導擬南芥產生系統抗性，促進側根的生長和根尖根毛的生長。側根數目和長度的增加以及根尖根毛的增加大大增加了擬南芥吸收水分和營養物質的能力，從而促進了擬南芥的生長。但是并不是所有的菌株產生的VOCs都有可以促進擬南芥的生長，如DZH3和DZQ8對擬南芥的生物量并沒有太大的影響，但是它們卻使得根尖根毛增加。這說明特定菌株對于擬南芥的生長促進作用具有特異性。

在試驗中還發現了一個有趣的現象，接種了一些PGPR菌株的擬南芥葉柄和葉片背面會出現紫色。這種紫色是植物經由苯基丙酸途徑和類黃酮途徑產生的一類天然的水溶性色素花色素苷所呈現的顏色,花色素苷主要存在于植物的花、果實、葉以及根、莖等器官細胞的液泡中,一般呈現紅色、藍色或紫色[19]。大量研究表明作為植物次生代謝產物,花色素苷是有多種生理功能的一類保護因子:（1）增強植物的抗氧化能力[20]；（2）增強植物的光保護能力[21]；（3）增強植物的抗蟲抗病及抗機械損傷能力[22]；（4）增強植物的抗旱能力[23]；(5)成為植物細胞和某些真菌共生基因的信號分子[24]。當植物受多種脅迫條件的誘導，葉片可產生中花色素苷,對植物適應環境條件的改變有重要作用。在本試驗中P1菌株對擬南芥的促生效果非常明顯，對根構型的影響表現為LRN和側根長度有了比較明顯的增加。這可能是其產生的某種或幾種VOCs能誘導植物體內花色素苷的合成或者積累。

Ryu等[11]和Farag等[12]研究證明，細菌產生的揮發物2,3-丁二醇和3-羥基-2-丁酮對擬南芥有促生效果。本次試驗并沒有發現這兩種揮發性氣體，但是卻檢測出了這兩種氣體的相似物質1,3-丁二醇，將擬南芥暴露于1,3-丁二醇中培養，結果發現1,3-丁二醇也可以促進擬南芥的生長、調整根構型。一些PGPR菌株產生的酸性物質，通過試驗表明大部分是沒有效果的，推測這些酸性氣體應該是細菌發酵產生的，與細菌間信息的交流有關系，對植物的影響不大。

一些PGPR菌株產生的VOCs也能抑制某些病原菌的生長，間接的促進植物的生長。Fernando等[25]鑒定的抑制菌絲生長和菌核的生成的6類物質分別為苯丙噻唑、環己醇、癸醛、二甲基三硫化物、2-乙基-1-己醇和壬醛。本試驗也證明癸醛能夠在很微量的情況下殺死擬南芥，這說明癸醛是一種有毒氣體，不僅對病原菌而且對植物也有很強的毒害作用。但奇怪的是有六株PGPR菌株都產生了癸醛，擬南芥長勢卻很好，對病原菌也有很明顯的抑制作用。這可能是因為有的氣體可以降低癸醛對植物的危害，但是卻沒有降低其對病原菌的毒害作用。

現在測VOCs常用的方法是GC/MS法,然而很多氣體由于不存在于已知數據庫中而很難被測定，還有一些氣體因為太微量而無法測出。故這項工作還有很大的研究空間。

4 結論

本試驗首次驗證了13株不同屬種的PGPR菌株對擬南芥有不同程度的促生作用，檢測出其產生的VOCs成分，證明了1,3-丁二醇對擬南芥有很明顯的促生作用。

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Effects of Volatiles Produced by Some Plant Growth-promoting Rhizobacteria of Tobacco on Root Architecture of Arabidopsis thaliana

LI Min1,ZHANG Peng-peng2,LIU Kai3,SHAO Lan-jun1,YAO Liang-tong3, DU Bing-hai3,DING Yan-qin3*
1.China Tobacco Hunan Industry Co.Ltd.,Guangzhou 510000,China
2.Qingdao Mingyue BlueOcean Bio-technology Co.Ltd.,Qingdao 266400,China
3.College of life science,Shandong Agricultural University/Shandong Key Laboratory of Agricultural Microbiology,Taian 271018,China

To studied the performance of volatiles from 13 kinds of plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR）for promoting growth of Arabidopsis thaliana,the bacteria were screened out using special divided plastic petir dishes and volatile organic compounds were identified by SPMS-GC-MS.Results showed that the VOCs produced by the 13 strains could promote growth and modulate root-system architecture of A.thalianain in different degree.Effects of volatiles produced by P1,MD8 and FGH19 strains on A.thaliana were very remarkable,with average A.thaliana fresh weight 38.78, 30.58 and 23.70 mg/strains respectively,increased 5.71,4.29 and 3.10 times compared with the control,respectively.PRL of A.thalianaline with DZQ8 treated was 8.03 cm,increasing 0.85 times compared to the control.The LRN of A.thaliana with TZQ33 and TZQ36 treated were more obviously,37.50 and 40.50,respectively,increasing 1.17 and 1.35 times.the LRD of MTQ8,MD8,TZQ33 and TZQ36 treated A.t haliana were 6.20,7.07,7.35 and 7.33 cm-1,respectively,and increased 0.55, 0.77,0.84 and 0.83 times compared to the control.Based on the analysis and verification of volatile organic compounds,we are first to discover that 1,3-Butanediol produced by MTQ8 can obviously promote the growth of A.Thaliana.The VOCs can promote growth and modulate root-system architecture of A.Thalianaandwehave identifiedinfirsttimethatthe 1,3-butanediolcan promotethe growthofA.Thalianaand adjusttheroot architecture.

Plant growth-promoting rhizobacteria(PGPR);volatile organic compounds(VOCs);growth-promoting effect; Arabidopsis thaliana

S154.38+1

A

1000-2324(2015)03-0347-06

2013-07-25

2013-08-11

廣東中煙工業有限責任公司資助項目(粵煙工15XM-QK[2011]-001)

李敏(1980-),男,湖北廣水人,本科,農藝師,主要從事原料研究和煙葉計劃工作;張鵬鵬(1987-),女,山東泰安人,碩士,研發員,主要從事植物根際促生細菌研發工作.

*通訊作者:Author for correspondence.E-mail:dingyq6885@163.com