酶水解pH值對酸性亞硫酸氨鹽預處理楊木糖化效率的影響

王 琰，朱楊蘇，勇 強，金永燦*

酶水解pH值對酸性亞硫酸氨鹽預處理楊木糖化效率的影響

王 琰1，朱楊蘇1，勇 強2，金永燦1*

（1. 南京林業大學 江蘇省制漿造紙科學與工程重點實驗室，江蘇 南京 210037；2. 南京林業大學 林木遺傳與生物技術教育部重點實驗室，江蘇 南京 210037）

改變酶水解pH值可以影響木質纖維生物質碳水化合物的酶水解糖化作用效果。以經酸性亞硫酸氫鹽預處理的楊木漿為底物，探究了酶水解pH值對其碳水化合物轉化率的影響。結果表明，預處理楊木漿的酶水解總糖得率隨pH值增加呈現先升高后趨于平緩的規律，酶水解最佳pH值范圍為4.8～5.4。當酶水解液pH值為4.8時，經6%亞硫酸氫鈉預處理楊木漿在20 FPU/g酶用量下水解，葡聚糖和總糖轉化率達到最高值，分別為91.3%和84.3%。

pH值；預處理；酸性亞硫酸氫鹽；酶水解；糖轉化率

利用可再生的木質纖維生物質，通過預處理和酶水解將其中的碳水化合物轉化成單糖，后續發酵并提純生產生物乙醇[1]。木質纖維生物質制備生物乙醇是當前新能源開發利用的熱點之一，符合我國可持續發展戰略。但由于木質纖維生物質中纖維素、半纖維素和木質素會形成致密的網狀結構，直接對其酶水解的效果較差，因此必須采用適當的預處理。預處理可以降低木質素和半纖維素的含量[2-8]，降低纖維素的結晶度，增加纖維素的比表面積和孔隙率，以提高纖維素對酶的可及性。亞硫酸氫鹽預處理源自制漿造紙工業中的亞硫酸鹽蒸煮，是在酸性條件下降解半纖維素使之溶出，通過磺化作用使木質素引入親水性的磺酸基并溶出部分木質素，增加纖維素酶的可及度，從而提高底物的酶水解效率。大量研究表明該方法能有效促進木質纖維生物質酶水解糖轉化效率，纖維素轉化率高達90%，并且產生較少的發酵抑制物[9-13]。

酶水解糖化作用是生產生物乙醇過程中成本較高的步驟之一。一般認為，纖維素酶的活性在pH值4.5～5.0范圍內最大，而且超出該范圍時，酶的活性降低。例如，Novozymes建議的Trichoderma reesei纖維素酶和CTec2的酶水解最適pH值分別為4.8和5.0，美國能源部標準實驗方法特別注明木質纖維生物質的酶水解緩沖液pH值為4.8[14]。但有研究指出，纖維原料的預處理方法有可能影響底物的最適pH值，如美國林產品研究所發現，提高酶水解pH至 5.2～6.2可以促進SPORL法預處理漿料的酶水解糖化作用[15-16]。本文主要探討酶水解pH值對酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿料酶水解糖化的影響。

1 實驗

1.1 材料

速生楊木（Populus deltoids），取自蘇北，原木去皮后旋切成厚度約為2 mm的薄片，手工剪成長×寬約為30 mm×20 mm的木片，風干后置于密封袋中平衡水分。原料的主要化學成分如表1所示。

表1 楊木原料的主要化學成分

酶水解所用酶液為Cellic?CTec 2復合酶（Novo Nordisk A/S，Demark），酶活力以纖維素酶活計，按文獻[17]的方法測定其濾紙酶活。根據文獻[18]配制有效緩沖范圍為4.5～5.7的醋酸―醋酸鈉緩沖溶液。

1.2 酸性亞硫酸氫鈉預處理

酸性亞硫酸氫鈉預處理在自制10×1.25 L回轉式電加熱油浴蒸煮器中進行。每個蒸煮罐中加入100 g絕干楊木木片，亞硫酸氫鈉用量（相對于絕干原料，w/w）分別為0%、2%、4%、6%、8%，硫酸用量為0.92%（w/w），固液比1∶5（w/V），與藥液充分混合后在80℃下回轉預浸漬30 min，以1℃/min的速率升溫至170℃，保溫30 min完成預處理。

經預處理的楊木用水充分洗凈，離心脫水后置于密封袋中平衡水分，稱重、測定水分含量并計算得率。取部分樣品用于化學成分分析，余下部分用雙圓盤磨漿機（磨盤直徑300 mm，磨片間距0.04 mm，轉速3 000 r/min）疏解成漿，重復磨漿兩次。所得漿料經離心脫水，撕碎后置于密封袋中平衡水分備用。

1.3 酶水解

精確稱量稱取相當于0.5 g葡聚糖的預處理漿料于150 mL錐形瓶中，在不同pH值的緩沖溶液中進行酶水解，酶水解底物濃度為2%，以每克葡聚糖為基準的酶用量（下同）為20 FPU/g，用醋酸―醋酸鈉緩沖溶液調節酶水解pH值分別為4.5、4.8、5.1、5.4和5.7。將錐形瓶置于恒溫振蕩器（SHA-C，上海精宏）中，在180 r/min和50±2℃條件下振蕩處理48 h。酶水解結束后將酶水解液和殘渣混合物轉移至離心管中，在5 000 r/min下離心20 min，取上清液分析其中各單糖的含量。

1.4 分析與檢測

1.4.1 原料及預處理漿料成分分析

楊木原料及預處理的漿料的苯―醇提取物和灰分根據國家標準分析[19]。楊木原料及預處理楊木漿中的木質素含量根據美國能源部的方法分析[20]。用G3玻砂漏斗真空過濾分離Klason木質素和酸水解液，計算Klason木質素時扣除灰分（575℃灼燒）含量；取0.5 mL酸水解液，用4% H2SO4稀釋定容至10 mL，以稀釋后的水解液為樣品，以4% H2SO4為參比，用紫外―可見分光光度計（UV-1800，Shimazdu）測定波長205 nm處的吸光值，計算酸溶木質素（ASL）的含量。

1.4.2 原料、預處理漿料和酶水解液中糖含量檢測

采用高效液相色譜（HPLC，Agilent 1200 Series，USA）分析單糖含量，分析柱和保護柱分別為Bio Rad Aminex HPX-87H 20 n（300 mm×7.8 mm）和Cation-H Refill Cartridges（30 mm×4.6 mm）（Bio-RadLaboratories，USA），進樣量為10 μL，流動相為5 mmol/L H2SO4，流速為0.6 mL/min，柱溫55℃。檢測器為RID示差檢測器，外標法測定。酶水解清液用去離子水稀釋10倍，經0.22 μm尼龍濾器過濾后進樣；原料或預處理漿料測定木質素時得到的水解液，用50%（w/w）NaOH水溶液調節pH至1～3以滿足HPLC的進樣pH范圍，經0.22 μm尼龍濾器過濾后進樣分析還原糖的含量。檢測結果為水解液中單糖的含量，為便于計算酶水解糖轉化率，分別將六碳糖乘以0.9，五碳糖乘以0.88，換算成樣品中聚糖的含量。本研究酶水解還原糖轉化率定義為水解液中各聚糖與預處理物料中各聚糖的質量百分比，所有的數據均為兩次平行實驗的平均值。

2 結果與討論

2.1 酸性亞硫酸氫鈉預處理對楊木得率和預處理液pH的影響

亞硫酸氫鈉用量對楊木預處理得率及預處理液pH值得影響如表2所示。楊木經酸性亞硫酸氫鈉預處理后其物料得率隨著亞硫酸氫鈉用量的增加先減小后趨勢漸緩。在亞硫酸氫鈉用量為0時，硫酸主要水解半纖維素，由于纖維素的聚合度高，結晶度高，在硫酸水解過程中降解較少，因此楊木漿料得率高。隨著亞硫酸氫鈉用量增加，預處理液中親核試劑HSO3-和SO2·H2O的濃度增大，促進了木質素的磺化反應，使木質素磺化溶出，并且硫酸降解部分碳水化合物，因此得率下降。當亞硫酸氫鈉用量為8%時，pH增加會抑制半纖維素的水解[21]，因此得率趨于平緩。此外，酸性預處理能降解木質素―半纖維素復合體。由于半纖維素和木質素的主要連接鍵型是苯基糖苷鍵、酯鍵、苯甲醚鍵、半縮醛和縮醛鍵，在酸性亞硫酸氫鈉預處理中，硫酸會破壞木質素和半纖維素之間α-芳基醚鍵連接的作用，并且苯甲醚鍵、酯鍵和苯基糖苷鍵易被酸水解，因此酸性預處理物料得率較低[22]。

表2 酸性亞硫酸氫鈉預處理對楊木漿料得率及預處理液pH的影響

預處理液pH值隨著亞硫酸氫鈉用量的增加先減小，后趨勢漸緩。預處理初始時半纖維素會水解生成乙酸、糖醛酸等[22]物質，使預處理液pH值降低；隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，預處理液pH值趨于平緩。

2.2 酸性亞硫酸氫鈉預處理對楊木主要成分的影響

不同亞硫酸氫鈉用量預處理后的楊木漿料化學成分含量（以初始原料為基準）的變化如表3所示。亞硫酸氫鈉用量為0%（即稀酸預處理）時，由于木質素結構單元間的主要連接鍵型―酚型和非酚型的β-O-4在酸性條件下不斷裂，只能斷裂部分α-芳基醚鍵，因此木質素脫除率低。隨著亞硫酸氫鈉用量增加，預處理液中親核試劑HSO3-和SO2·H2O濃度增大，原料中木質素磺化溶出，因此殘余木質素含量隨著亞硫酸氫鈉用量的增加而減少。此外，亞硫酸氫鈉用量增加導致Klason木質素含量顯著下降，而酸溶木質素的含量變化較小，可能是由于楊木漿料中被磺化的木質素具有良好的親水性，在測定木質素含量時更易溶出，使得酸溶木質素含量保持穩定。

表3 酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿料的主要化學成分

葡聚糖和木聚糖的總和反映了楊木原料中高聚糖的含量。一般而言，楊木高聚糖的含量隨著預處理條件的增強而降低。由表3數據可發現，楊木漿料中的高聚糖含量隨亞硫酸氫鈉用量的增加先下降后趨勢漸緩。在低pH值條件下，纖維素和半纖維素水解，起始楊木漿料中的葡聚糖含量下降。隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，pH值增加，纖維素水解速率變慢，因此葡聚糖的相對含量增加。在酸性條件下，半纖維素容易降解，因此木聚糖降低幅度較大，最高降幅約70%。相比較而言，葡聚糖降幅最高為12%左右，說明酸性預處理主要降解半纖維素。

木質素是影響木質纖維原料酶水解的主要因素之一，脫除木質素通常會提高酶水解效率[22]。但是，隨著預處理條件的增強，脫除木質素的同時會降解高聚糖，使漿料得率下降。為了提高酶水解糖化效率，需要較高的漿料得率，即脫除木質素的同時減少高聚糖的降解。如圖1所示，隨著木質素脫除率的增大，楊木漿料預處理得率呈先快速下降再平緩的趨勢，說明增加亞硫酸氫鈉用量會降低脫木質素選擇性。

2.3 酶水解pH值對酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿酶水解性能的影響

不同pH值酶水解體系對酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿酶水解還原糖的轉化率如表4所示。相同預處理條件下，葡聚糖和總糖轉化率隨著酶水解液pH值的增加先增大后趨于平緩，木聚糖轉化率變化較小。楊木預處理漿料中葡聚糖的含量遠大于木聚糖的含量，酶水解液中的葡萄糖含量也遠大于木糖的含量，故葡聚糖轉化率的變化規律與總糖相似。

圖1 木質素脫除率對預處理固形物得率的影響

表4 酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿料不同酶水解pH下糖的轉化率（以預處理物料為基準）

續表4

由表4可見，酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿料的最佳酶水解糖化作用的緩沖液pH值為4.8～5.4。Wood等[23]研究表明若纖維素酶的催化活性在某一pH值時最大，則此pH值為酶的最適pH值。由表4數據可見，酶水解體系的pH值對酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿的糖轉化率具有顯著的影響。當pH值由4.5升至4.8時，酶水解中葡聚糖、木聚糖和總糖的轉化率均快速遞增；pH值繼續增至5.7時，酸性亞硫酸氫鈉預處理漿的葡聚糖和總糖轉化率趨于平緩而后又下降，而木聚糖則是先下降后升高的趨勢。因此，酸性亞硫酸氫鈉預處理后底物酶水解的最佳pH值范圍為4.8～5.4。

木質素脫除率是影響酶水解效率的重要因素，在亞硫酸氫鈉用量不同的預處理條件下，酶水解總糖轉化率與木質素脫除率的關系如圖2所示。對木質纖維生物質預處理，并不需要脫除全部的木質素來達到最高的酶水解效率，一般而言，脫除原料中20%～65%的木質素就可以提高酶對纖維素的可及性[24]。由圖2可見，隨著木質素脫除率的增加，楊木漿料酶水解總糖轉化率增加，當預處理后楊木中木質素脫除率為55%左右時，酶水解總糖轉化率就可達到最大值，繼續脫除木質素反而會過多地降解碳水化合物，不利于提高總糖轉化率。

圖2 木質素脫除率對酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿糖轉化率的影響

3 結論

1）酸性亞硫酸氫鈉預處理對楊木化學成分有顯著影響，隨著亞硫酸氫鈉用量的增加，楊木木質素脫除率上升，碳水化合物加劇降解，其中半纖維素降解程度大于纖維素。預處理后楊木漿料得率先快速下降后趨勢漸緩。

2）楊木各聚糖轉化率隨著亞硫酸氫鈉用量的增加先升高后下降?？偺寝D化率隨著木質素脫除率的增加而上升，但當木質素脫除率約為55%時，繼續脫除木質素不能有效提高總糖轉化率。

3）酸性亞硫酸氫鈉預處理楊木漿的酶水解最佳pH值范圍為4.8～5.4，經6%亞硫酸氫鈉預處理楊木漿在酶水解液pH值 4.8和20 FPU/g下酶水解，葡聚糖和總糖轉化率分別達到91.3%和84.3%。

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Effects of pH on the Enzymatic Saccharification of Acid Sodium Bisulfite Pretreated Poplar

WANG Yan1, ZHU Yang-su1, YONG Qiang2, JIN Yong-can1*
（1. Jiangsu Provincial Key Lab of Pulp and Paper Science and Technology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China; 2. Key Laboratory of Forest Genetics and Biotechnology, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China）

Changing the pH of enzymatic hydrolysis could affect the enzymatic saccharification of lignocellulosic biomass. Acid sodium bisulfite pretreated poplar pulps was used as substrate for exploring the effects of enzymatic hydrolysis pH on the enzymatic saccharification. The results showed that the sugar yield and conversion of enzymatic hydrolysis of pretreated poplar tended to increase, then became gentle with the increase of pH. The range of optimal hydrolysis pH was 4.8～5.4. After hydrolyzed at pH 4.8 and 20 FPU/g, the glucan and total sugar conversion of poplar pretreated with 6% sodium bisulfite reached up to 91.3% and 84.3%, respectively.

pH; pretreatment; acid bisulfite; enzymatic saccharification; sugar conversion

TQ352.62

A

1004-8405(2015)03-0015-07

10.16561/j.cnki.xws.2015.03.03

2015-04-22

“十二五”國家科技支撐計劃（2015BAD15B09）；高等學校博士學科點專項科研基金（20133204110006）；江蘇省基礎研究計劃（自然科學基金）（BK20141473）；江蘇省高校優勢學科建設工程資助項目。

王 琰（1990～），男，碩士研究生；研究方向：生物質資源化學與工程。

* 通訊作者：金永燦（1968～），博士，教授。jinyongcan@njfu.edu.cn