生防芽孢桿菌的研究進展

孫冰冰+李偉+魏軍+田濤

摘 ? ?要：利用芽孢桿菌防治植物病害是生物防治的一個重要內容。生防芽孢桿菌種類多，作用范圍廣，生防芽孢桿菌類微生物制劑能夠有效控制植物病害，因此，生防芽孢桿菌在現代農業中有廣闊的應用前景。本文就針對生防芽孢桿菌種類及其生防作用機制、國內外生防芽孢桿菌微生物制劑化研究現狀及其在應用中存在的問題及對策分析展開簡要論述。

關鍵詞：芽孢桿菌;植物病害;生物防治;研究進展

中圖分類號：S182 ? ? ? ? ? ?文獻標識碼：A ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.12.025

Research Progress in Biocontrol of Bacillus spp.

SUN Bing-bing， LI Wei， WEI Jun， TIAN Tao

（Plant Protection Institute， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300381， China）

Abstract： Using Bacillus spp. to control plant disease is one of the main strategies in biological control. Biocontrol Bacillus spp. not only have species diversity， but also have broad spectrum activity against many pathogens. The microbial biocontrol agent Bacillus spp. can effectively control plant disease， so it will have vast prospect of application in modern agriculture. This paper briefly reviewed the diversity and the biocontrol mechanism of biocontrol Bicillus spp.， introduced its research progress at home and abroad， analyzed the problems in use and proposed the corresponding countermeasures.

Key words：Bacillus spp.; plant disease; biocontrol; research progress

植物病害不僅能降低作物產量、降低作物品質、降低農民收入，而且有些植物病害會產生有毒物質，危害人以及牲畜的生命安全[1]。此外，長期以來人們高頻使用化學藥劑防治植物病害，不但造成嚴重的病原菌抗藥性問題，沒有控制住病害的發生反而加重了土壤農藥殘留，嚴重污染了環境。隨著人們對食品安全及環保的日益重視，隨著生態農業理念的提出，一些化學藥劑在許多發達國家和地區已被限制使用[2]。生物防治是利用有益微生物對植物病害病原菌的不利作用，來削弱病原菌致病性和減少其數量[3]。生物防治不污染環境、對人無毒害、不產生抗藥性[4]，生物防治植物病害新策略符合人們對綠色食品的需要，符合環境保護和農業可持續發展的要求，越來越受到植保工作者的青睞。作為植物病害生物防治的開拓者，陳延熙1979年在北京農業大學成立了中國第一個植物病害生物防治研究室，他提出的植物體自然生態系概念以及據此而創制的“增產菌”，為中國植物病害生物防治提供了理論和應用依據。隨著分子生物學、基因工程、發酵工程、酶工程等學科領域新技術的發展，生防微生物制劑的問世創造了巨大的社會效益和經濟效益，表現出良好的應用前景。

細菌廣泛分布于土壤和水中，或者與其他生物共生，種類資源豐富。此外，生防細菌還具有繁殖速度快、代謝產物復雜多樣、與病原菌作用方式廣、易于人工培養等特點。生防細菌及其代謝產物在生物防治中均發揮了非常重要的作用[5]。芽孢桿菌（Bacillus spp.）是在科研和生產中應用較多的生防細菌[6]。近幾年來，分子生物學技術與生物工程技術相結合為生防芽孢桿菌的應用提供了新的技術和新的途徑，目前，已有許多芽孢桿菌被研制成為微生物生防菌劑，而且廣泛應用于生產實踐中。本文就針對生防芽孢桿菌種類及其生防作用機制、國內外生防芽孢桿菌微生物制劑化研究現狀及其在應用中存在的問題及對策分析展開簡要論述。

1 生防芽孢桿菌的種類及其作用機制

芽孢桿菌是植物和土壤環境微生態區系的優勢種群，許多優良菌株表現出對多種植物病原菌具有拮抗作用[6-8]。生防芽孢桿菌本身抗逆性強，耐高溫、酸堿和紫外線，而且具有殺菌高效、防治效果好、安全性評價好、易于制劑化且成本較低、能誘導抗病性及促生增產等優點。目前應用于生物防治研究中的芽孢桿菌的種類主要有枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、及多粘芽孢桿菌（Bacillus polymyxa）等[9]。生防菌對病原菌的生防機制主要有拮抗、溶菌、競爭、重寄生、捕食和交叉保護等。生防芽孢桿菌的生防機制主要表現在拮抗、競爭、溶菌、誘導植物抗病性等方面。生防芽孢桿菌擁有良好的生防效果往往是由多種拮抗物質或多種生防機制共同作用而致。楊佐忠證實Bacillus subtilis PRS5能防治由R. soalin引起的杉苗猝倒病，是其對病菌的抗生、溶解以及對寄主促生作用的綜合體現，并以抗生作用為主[10]。

1.1 抗菌作用機制

拮抗微生物在代謝活動中產生的直接對病原物產生抑制作用的拮抗物質是其發揮生防作用的物質基礎。生防芽孢桿菌產生的拮抗因子主要分為兩類：一是抗生素類;二是拮抗蛋白。

抗生素類抗菌物質是生防芽孢桿菌表現抗菌作用的重要物質基礎之一。Arima等[11]首次發現枯草芽孢桿菌產生的表面活性物質，即表面活性素（Surfactin），具有抗病毒、抗支原體和抗細菌活性的作用。此外，表面活性素能降低植物根部表面張力，為生防芽孢桿菌的游動和生物膜形成創造有利條件，保護根部免受病原菌的入侵[12-14]。伊枯草菌素與表面活性素不同，表現出較強的抗真菌能力和一定程度的抗細菌能力。張桂英等發現甘蔗黑穗病菌拮抗性芽孢桿菌的抗菌作用與伊枯草菌素A的產生有關[15]。Arrebola E等[16]發現伊枯草菌素A是B. amyloliquefaciens PPCB004防治蔬果采后真菌病害（Botryosphaeria sp.、Lasiodiplodia. Theobromae、Penicillium. Crustosum和Phomopsis. persea）的主要抑菌物質。生防菌B. subtilis M51產生伊枯草菌素A2，能抑制多種絲狀真菌生長，能抑制尖孢鐮刀菌對番茄的侵染[17]。泛革素與表面活性素、伊枯草菌素被公認為生防芽孢桿菌產生的重要的抗菌活性物質。生防菌B. subtilis F2923能產生泛革素（Fengycin），是由10個α-氨基酸肽與β-羥基飽和或非飽和脂肪酸鏈（C14～C18）形成內酯環，可以抑制多種絲狀真菌生長[18]。生防芽孢桿菌還可以產生一些其他抗生素，如分枝環肽類、二肽類、線狀聚酰胺物和多肽類物質等，對原核生物和真菌具有廣譜的抑菌活性。而且一株生防芽孢桿菌可以同時產生兩種及以上的抗生素類物質，協同作用表現出很好的抗菌能力。Stabb等[19]報道生防菌株B. cereus UW85能高效地抑制由Pythium medicaginis引起的苜蓿猝倒病，它可以分泌兩種抗生素Kanosamine和Zwitter mycin A，直接抑制病原菌的生長。朱震等[20]報道的生防菌B. amyloliquefaciens XZ-173能同時產生表面活性素和伊枯草菌素A，對立枯絲核菌和青枯菌表現出很好的拮抗活性。

研究表明，有些生防芽孢桿菌可以產生拮抗蛋白類物質，如細菌素、細胞壁降解酶類（如幾丁質酶、β-1，3-葡聚糖酶等）以及一些未知的蛋白，拮抗蛋白是生防芽孢桿菌表現抗菌作用的另一重要物質基礎。生防芽孢桿菌還能產生多種對革蘭陽性細菌具有很強的拮抗作用的細菌素。Subtilin、Subtilosin和Megacins分別由枯草芽孢桿菌及巨大芽孢桿菌產生，均對革蘭陽性細菌具有很強的抑菌活性。M-4 Amoebicidal由生防菌B. licheniformis M-4產生，同時具有抗細菌、抗真菌的能力[16，21]。大部分生防芽孢桿菌可以產生幾丁質酶或β-1，3-葡聚糖酶或者同時產生兩種酶，均屬細胞壁降解酶類，可以協同作用溶解病原真菌的菌絲，可同時把從病原物細胞壁或寄主釋放出的葡萄糖片段作為信號分子，誘發寄主植物的防御反應。溶幾丁質芽孢桿菌（B.chitinovirous）被Benecke[21]首次報道可以產生幾丁質酶。此外，環狀芽孢桿菌（B. circulans）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）、巨大芽孢桿菌（B. megaterium）及地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）均能產生幾丁質酶或者可以同時產生β-1，3-葡聚糖酶。蠟樣芽孢桿菌B. cereus CH能產生4種幾丁質酶，地衣芽孢桿菌（B.licheniformis）能產生5種幾丁質酶，巨大芽孢桿菌（B.megaterium）能產生3種幾丁質酶[22]。環狀芽孢桿菌（B.circulansWL-12）則產生6種幾丁質酶和2種β-1，3-葡聚糖酶[23]，B. subtilis HL-25和B. circulans IAM1165只產生β-1，3-葡聚糖酶[24]。拮抗蛋白在生物防治中的作用日益凸顯，生防菌拮抗蛋白的研究越來越多。胡劍等[25]從生防菌B. subtilis BS-98培養物中分離純化的抗菌蛋白對蘆筍莖枯病菌、小麥赤霉病菌、棉花枯萎病菌、棉花黃萎病菌、灰霉菌、立枯絲核菌等病原真菌及黃瓜角斑病菌都具有強烈的抑制作用。王雅平等[26]研究表明B. subtilis A104對小麥赤霉菌的抑菌作用中拮抗蛋白占了較大比例。陳艷芬等[27]明確B. subtilis BSY-2發揮拮抗作用的主要活性物質為分泌的抗菌蛋白。Yoshida等[28]從B. amyloliquefaciens RC22中提取的拮抗蛋白對桑樹終極腐霉菌（Pythium ultimum）有很好的拮抗能力。李晶等[29]研究表明B. subtilis B29菌株分泌的抗菌蛋白不僅抑制病原菌的生長;還可抑制尖孢鐮刀菌孢子的萌發，使分生孢子萌發畸形。生防芽孢桿菌拮抗蛋白的生防作用在平板拮抗和田間防效試驗中研究較多，而在生產實踐中的應用報道較少。

1.2 溶菌作用機制

溶菌現象在植物病害生物防治中是比較普遍的，它導致芽管或菌體消解。溶菌現象分自溶性和非自溶性，后者可能是生防菌產生的酶或其他抗菌物質所造成的，也可能是細菌被噬菌體侵染導致的，有潛在的研究意義。林福呈等[30]報道了B. subtilis S9能分泌某些溶菌物質，對立枯絲核菌（R. solani）、終極腐霉（P. ultimum）及西瓜枯萎病菌（F. oxysporm. f. sp. niveum）有不同程度的溶菌作用，能有效地控制R. solani引起的番茄苗期病害。

1.3 競爭作用機制

生防菌的競爭作用又稱占位作用或腐生競爭，主要是對植物體表侵染位點的競爭及對氧氣與養分的營養競爭。生防枯草芽孢桿菌以位點競爭占優勢，營養競爭只是在少數菌株中被發現。玉米內生芽孢桿菌相比其病原菌串珠鐮孢菌（Fusarium moniliforme Sheldon）可以在玉米體內快速定殖和繁衍而具有位點競爭優勢，能有效減輕串珠鐮孢菌及其毒素的為害[31]。營養競爭是生防芽孢桿菌與其他微生物及病原物爭奪土壤微生態環境中微生物生長發育必需的氮素和碳素營養等。利用生防芽孢桿菌對鐵離子的競爭可以抑制植物根部的病害。因此，生防芽孢桿菌發揮拮抗作用的關鍵是在植株根部有效地定殖。

1.4 誘導植物抗病性

生防芽孢桿菌能通過激發植物的誘導系統抗病性（ISR）提高植物抗病能力。B. subtilis S499產生的2種細菌素（Surfactin和Fengycins）協同作用可以激活植株產生ISR[32]，陳劉軍等[33]研究證明B. cereus AR156能通過同時激發系統獲得抗性SAR和ISR兩條信號途徑誘導番茄和擬南芥產生抗病性。植物誘導抗病性可以由病原物誘導，也可以由非病原物誘導，兩者雖然在信號通路上有所不同卻具有相同的表型特征，例如產生植保素及組織木質化等，這一系列生物過程會涉及超氧化物歧化酶（SOD）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）、多酚氧化酶（PPO）和過氧化酶（POD）等酶類的活性。陳志誼等研究B. subtilis B-916對水稻植株的抗誘導作用，發現在接種B-916和紋枯病菌RH-2后對水稻組織內PAL、POD、PPO、SOD4種酶活性的影響，雖然在數量上酶的活性水平有差異，但是總體變化趨勢表現一致，在接種后24 h，PAL和SOD活性最先達到最大值，隨后POD在48 h后活性達到最高峰，PPO則在72 h出現高峰值。葉面噴施B. subtilis B-916后通過誘導提高植株內某些與抗病性有關的酶類活性，從而增強水稻抗病性[34]。Jetiyanon等[35]報道B. pumilus菌株SE49能誘導黃瓜對膠胞炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）產生誘導抗病性活性。經典的誘導抗病性的產生是先接種病原物或某種誘導物，導致接種部位先產生枯斑，然后植株產生系統抗病性。研究表明，生防芽孢桿菌產生的脂肽類抗生素（表面活性素、伊枯草菌素、泛革素）能提高生防菌在植株根際土壤的生態適應能力，通過誘導抗病性來保護植物免受侵害[36]。

2 國內外生防芽孢桿菌微生物制劑化研究現狀

我國對芽孢桿菌制劑化研究已達到世界領先水平。國內科研工作者對生防芽孢桿菌進行了深入而廣泛的研究，并且已開發出具有優良生防作用的芽孢桿菌。江蘇農科院植保所與國際水稻研究所合作研發出生物殺菌劑Bs-916，已進行農藥登記，年使用面積達到6.7萬hm2。對水稻白葉枯病菌有顯著抑制作用，對水稻紋枯病的田間防效穩定在75%～85%，對稻曲病的田間防效高達85.7%。中國農業大學研制的水稻、小麥、蔬菜和經濟作物增產菌系列產品，主要的生防菌為蠟樣芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌等，推廣面積達1 667.5萬hm2之多，增產幅度穩定在10%～20%，并且具有良好的抗菌防病效果。云南農業大學和中國農業大學共同研制的生物農藥百抗，主要成分是枯草芽孢桿菌B908，已進行農業部登記注冊，推廣面積達4 667 hm2，主要對水稻紋枯病、煙草黑脛病及三七根腐病有良好的防效，尤其對水稻紋枯病防效達70%以上。南京農業大學開發的生防菌B3（商品名：麥豐寧），主要成分是枯草芽孢桿菌，對小麥紋枯病田間防效穩定在50%～80%。江蘇蘇科農化有限公司推廣的紋曲寧（枯草芽孢桿菌水劑和井岡霉素的復混劑），對水稻紋枯病和稻曲病具有良好的防效。萊陽農學院的BL03和XM16菌株對棉花炭疽病和蘋果霉心病的田間防效為90%。昆明沃霖生物工程公司研發并登記注冊的根腐消，主要成分為枯草芽孢桿菌和熒光假單胞菌，對三七根腐病防效較好。武漢天惠生物有限公司生產并登記的枯草芽孢桿菌BS-208菌劑，對灰霉和白粉2種病害有較好的防治效果。河南省農科院植保所研發的解淀粉芽孢桿菌相關菌劑，主要用于瓜類和草莓白粉病的防治。黑龍江省應用微生物研究所研發的枯草芽孢桿菌菌劑，主要用于豆類根腐病、瓜類及保護地蔬菜枯萎病和立枯病的防治，已大面積推廣。

自Johnson等報道了枯草芽孢桿菌可以防治植物病害后，利用芽孢桿菌研制生防菌劑來防治植物病害的研究便成為植保工作人員的研究熱點。美國迄今已有5株芽孢桿菌獲得了環保局商品化生產應用許可，分別是GB03（商品名為Kodiak）、MB1600（商品名為Subtilex）、QST 2808（商品名為Sonata AS）、QST713（商品名為Serenade）和FZB24（商品名為Taegro）。GB03和MB1600主要用于對由Aspergillus、Altrernaria、Fusarium和Rhizoctonia引起的豆類、麥類、棉花及花生根部病害的防治;FZB24（解淀粉芽孢桿菌變種）主要作為植物促長劑，作用于室內栽培灌木、樹苗及裝飾植物根部，用于對由Rhizoctonia及Fusarium引起的枯萎病和根腐病的防治。QST713主要用于防治蔬菜、葡萄等的灰霉病、疫病、白粉病、霜霉病等病害。俄羅斯全俄植保所開發的枯草芽孢桿菌菌劑Alirine-B，可防治多種作物的真菌病害，田間防效高達95%，增產高達35%;另一個枯草芽孢桿菌菌劑Gamair，由活菌及其代謝物組成，主要防治番茄的多種細菌性病害。韓國Bio公司研發的生物殺菌劑Mildewcide，由枯草芽孢桿菌、植物抗真菌多糖及鏈霉菌抗生素混合制成，可防治蔬菜的白粉病、葡萄霜霉病、花卉、水果及水稻的真菌性病害。此外，澳大利亞研發的B. subtilis A-13菌劑，除了具有增產作用，對立枯病以及其他土傳病害亦有良好的防治作用。日本東京技術研究所開發的B. subtilis RB14菌劑及B. subtilis NB2菌劑對由Fusarium oxysporum、Rhizoctonia solani和Pseudomonas solanacearum引起的番茄病害有良好的防治效果。

3 生防芽孢桿菌應用中存在的問題及對策分析

微生物菌劑防治植物病害安全性好，環境污染小，在未來的農業病蟲害防治中有良好的應用前景。但是生防菌劑在科學研究與應用過程中存在室內拮抗與田間防效試驗結果不一致、田間防效效果不穩定的實際問題，成為影響生防菌的推廣和應用的瓶頸因素。因此，加強生防菌生防作用機制研究，提高其防治效果及穩定性是植保工作者的重點科研方向。

生防芽孢桿菌在田間應用的防治效果主要是由其定殖能力、生防因子的穩定性發揮及其與植物根圍土壤微生態系統正確的作用方式3個方面決定的。生防芽孢桿菌在植株根際的定殖與自身的生長特點以及土壤微生態環境息息相關。Gilbert等[37]研究表明，生防芽孢桿菌UW85浸種處理接種后雖然在大豆根部的定殖量不高，但是卻顯著影響了根際的微生態環境;在種植馬鈴薯田間接種生防鏈霉菌（Streptomyces spp.）1年后，鏈霉菌種群的多樣性并沒有顯著的變化，但是能夠引起馬鈴薯瘡痂病的致病型鏈霉菌（S. scabies）的可分離數量下降了85%[38];Gasoniet等[39]的研究結果表明，生防菌Trichoderma harzianum R3P2能夠促進特定微生物種群的生長，從而導致土壤微生態系統的演替;接種生防菌Pseudomonas jessenii RU47能夠顯著降低病原菌R. solani AG1-IB對萵苣根際微生態系統的影響[40];在自然土中生防菌Fusarium oxysporum F047的定殖量低于滅菌土中的定殖量，并且和接種量正相關，但是生防菌的有效定殖并沒有影響土壤中原有的微生態結構[41]。生防菌與病原菌、土著微生物群落及作物間存在復雜的相互作用，在田間的生防效果是這些因素相互作用的最終結果。生防菌與病原菌生防作用過程中有效的生防因子起到了直接的作用，有效生防因子的穩定性亦與植物根圍土壤的理化性質以及土壤微生態系統有關。因此，生防菌在施用后如要取得穩定生防效果，關鍵在于擁有適于生防菌生長的土壤微生態環境，解決生防菌應用的限制因素，建立一個不利于病原微生物生長的微生態環境。

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