醒腦通絡片對腦缺血損傷大鼠內源性神經干細胞的影響

郭建隊， 田 華， 黃毓娟， 方 瑜

（陜西中醫學院，陜西咸陽712046）

醒腦通絡片對腦缺血損傷大鼠內源性神經干細胞的影響

郭建隊， 田 華， 黃毓娟， 方 瑜

（陜西中醫學院，陜西咸陽712046）

目的 觀察醒腦通絡片 （黃芪、川芎、桃仁、紅花、雞血藤等）對腦缺血損傷大鼠內源性神經干細胞的影響。方法 將120只SD大鼠隨機分為假手術組和模型組 （生理鹽水灌胃），醒腦通絡片小、中、大劑量組5組，每組各24只，采用線栓法致大鼠腦缺血再灌注損傷模型。腦缺血再灌注后3、7、14、28 d時，神經功能評分后處死動物，用免疫組化法觀察缺血側海馬溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）、巢蛋白 （Nestin）的表達。結果 假手術組海馬區僅有少量BrdU、Nestin陽性細胞表達，模型組及醒腦通絡片各組再灌注3 d后BrdU、Nestin陽性細胞表達開始增多，7～14 d達高峰，28 d明顯下降。和模型組比較，醒腦通絡片各組BrdU、Nestin陽性細胞明顯增多 （P＜0.05或0.01）。醒腦通絡片各組在再灌注14和28 d神經功能均顯示恢復，和模型組比較有顯著性意義 （P＜0.05或0.01）。結論 醒腦通絡片可以促進內源性神經干細胞增殖、分化，可能為其治療缺血性腦血管病的機制之一。

醒腦通絡片；腦缺血再灌注損傷；溴脫氧尿嘧啶核苷 （BrdU）；巢蛋白 （Nestin）；神經干細胞；增殖

內源性神經干細胞（neural stem cell，NSC）主要存在于成年哺乳動物海馬齒狀回顆粒下層 （subgranular zone，SGZ）和側腦室室管膜下區（（subventricular zone，SVZ）［1］。正常情況下，這些神經干細胞處于休眠狀態，在病理狀態時如中風、癲癇、帕金森病等，這些細胞可以增殖、分化、遷移并整合到神經網絡修復神經功能［2］。缺血性腦血管病發生后神經細胞再生可以活躍數天甚至數周，被認為是治療的第二時間窗［3］。用藥物調控內源性NSC的增殖、分化、遷移，促進神經功能修復就成為當前研究的熱點之一。近年來研究發現，黃芪、川芎、絞股藍等中藥的提取物黃芪甲苷［4］、川芎嗪［5］、絞股藍總苷［6］和參芎滴丸［7］復方均能促進神經細胞增生。醒腦通絡片是陜西省名老中醫楊秀清教授結合三十多年臨床經驗，根據中風病機以氣虛為根本，漸致臟腑功能、氣血陰陽失調，氣虛血瘀，痹阻腦脈，腦竅失利組方配伍。其主要組成為黃芪、川芎、桃仁、紅花、雞血藤、地龍、水蛭、女貞子、決明子、冰片。經陜西中醫學院附屬醫院長期臨床實踐證實，醒腦通絡片是臨床治療缺血性中風的有效經驗方［8］。以往的研究顯示醒腦通絡片具有改善微循環、清除自由基等作用。為進一步探索醒腦通絡片治療缺血性腦血管病的機理，本實驗觀察醒腦通絡片對缺血大鼠內源性神經干細胞BrdU、Nestin表達的影響。

1 材料與方法

1.1 動物 健康SD大鼠120只，雌雄各半，日齡60 d，體質量250～300 g，SPF級。購自西安交通大學醫學院實驗動物中心。動物合格證號SCXK（陜）2012-003。

1.2 藥品及試劑 醒腦通絡片，陜西中醫學院附屬醫院制劑中心提供，批號20130320。經研磨、生理鹽水溶解，配制成小劑量14.12mg/mL（含生藥0.042 g/mL），中劑量28.24 mg/m L（含生藥0.084 g/mL），大劑量56.48 mg/mL（含生藥0.168 g/mL）的溶液。5-溴脫氧尿嘧啶核苷 （5-bromo-2-deoxyuridin，5-BrdU）（Sigma-Aldrich，美國）；小鼠anti-BrdU單克隆抗體（Sigma-Aldrich，美國）；兔抗巢蛋白（anti-nestin）多克隆抗體（Sigma-Aldrich，美國）。酶聯免疫吸附測定試劑盒及DAB顯色試劑盒 （武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 實驗儀器 TB-718E型生物組織包埋機（湖北泰維科技實業有限公司）；DQP-9010切片機（上海醫療儀器廠）；Leica數碼顯微鏡。

1.4 造模及分組 進行適應性喂養7 d后，參照Zea-longa［9］法行線栓法阻斷大鼠大腦中動脈以制作局灶性腦缺血動物模型。造模成功后，隨機分為假手術對照組、模型對照組、醒腦通絡片小、中、大劑量組。假手術組除實施假手術外，造模過程同模型組，每組24只大鼠。

醒腦通絡片3組于術后24 h開始給予醒腦通絡片灌胃，每次分別為小劑量組0.28 g/kg、中劑量組0.56 g/kg、大劑量組1.12 g/kg，每天2次，直到處死前1 d。模型組、假手術組給予生理鹽水（6.7 mL/kg）灌胃。5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）用生理鹽水溶解，腹腔注射 （下腹中點旁開1 cm），每組動物于處死前2 d開始給藥，12 h一次，每次50 mg/kg，共3次。

1.5 神經病學評分 參照Zea-longa［9］評分制，即0分，無神經功能缺損；1分，提尾懸空不能伸展右側前爪；2分，行走向右側轉圈；3分，行走困難，并向右側傾倒；4分，不能自發行走，無意識或昏迷。

1.6 腦組織切片制備 模型組和中藥組分別在腦缺血2 h再灌注后3、7、14、28 d各取6只處死取材：腹腔注射10%水合氯醛麻醉，剪開胸腔，充分暴露心臟，經左心室插入灌注針至升主動脈，動脈夾固定，剪開右心耳，用生理鹽水200 mL經動脈快速灌注，直到肝和肺臟顏色轉白及右心房流出液澄清；繼續用4%多聚甲醛緩沖固定液約200 mL動脈內灌注，持續30 min，至大鼠尾巴和四肢明顯僵硬后，斷頭取腦，標本置于4%多聚甲醛緩沖固定液；固定12 h后，腦組織冠狀切開以顯露海馬齒狀回；繼續固定海馬組織，24 h后將腦組織用酒精脫水，脫水后的標本經二甲苯透明，透明后的組織常規石蠟包埋、切片，片厚3μm，并將切片貼在防脫載玻片上，用恒溫烤箱60℃烤片12 h；選取缺血側海馬區域的腦組織切片染色，假手術組取對應位置的腦組織切片染色。

1.7 免疫組織化學方法檢測BrdU、Nestin表達石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗，0.01 M PBS浸泡5 min。室溫下，滴加新鮮的3%H2O2孵育10 min，滅活內源性過氧化物酶；用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。滴加5%～10%正常山羊血清封閉液，室溫孵育10 min，甩去多余液體，勿洗。滴加一抗50μL，37℃孵育1 h；再用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。滴加生物素化

二抗40～50μL，37℃孵育30 min；最后用0.01 M PBS沖洗，每次5 min，共3次。顯色劑顯色3～15 min（DAB），自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。在顯微鏡下觀察染色結果，陽性細胞呈棕黃色，BrdU定位于細胞核，Nestin定位于細胞漿，每只大鼠取缺血側齒狀回部位切片各3張，每張切片隨機選取5個非重疊視野，計數BrdU、Nestin陽性細胞數，計算陽性細胞數均值 （400倍視野）。

1.8 數據分析和統計處理 采用SPSS 13.0統計軟件包進行統計學處理。多組數據間差異的顯著性分析用單因素方差分析（One-way ANOVA），方差齊性檢驗用Levene法，方差齊時用Tukey法，方差不齊時用Games-Howell法檢驗。

2 結果

2.1 神經功能缺失評分 結果見表1。假手術對照組無神經功能缺損。醒腦通絡片各劑量組在再灌注7、14、28 d時，神經功能癥狀比模型組明顯減輕，與模型組比較有顯著性差異 （P＜0.05或0.01）。

表1 各組神經功能缺失評分比較Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

表1 各組神經功能缺失評分比較Tab.1 Comparison of neuro IogicaI function deficit scores in each group

注：與同時間點模型組比較，△P＜0.05，■P＜0.01；與同時間點假手術組比較，●P＜0.01

28 d假手術組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型組 — 3.17±0.41● 3.00±0.63● 2.17±0.41● 1.50±0.55●醒腦通絡片組 0.28 2.83±0.41 2.00±0.63△ 1.17±0.75△ 0.50±0.55△醒腦通絡片組 0.56 2.83±0.41 1.67±0.52■ 0.67±0.52■ 0.33±0.52■醒腦通絡片組 1.12 2.83±0.41 1.50±0.55■ 0.50±0.55■ 0.17±0.41■

2.2 各組腦缺血再灌注各時間點BrdU陽性細胞數 結果顯示，假手術組大鼠海馬齒狀回SGZ區有少量BrdU陽性細胞散在分布，模型組再灌注各時間點缺血側海馬齒狀回SGZ區BrdU陽性細胞數比假手術組明顯增加，與假手術組比較有顯著性差異 （P＜0.01）。醒腦通絡片各劑量組再灌注各時間點缺血側海馬齒狀回SGZ區BrdU陽性細胞數比模型組缺血側同部位明顯增加，與模型組比較具有顯著性差異 （P＜0.01），（見表2、圖1，BrdU陽性細胞細胞核呈棕黃色，×400）。

表2 各組各時間點BrdU陽性細胞數比較Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

表2 各組各時間點BrdU陽性細胞數比較Tab.2 Com parison of BrdU positive ceIIs at each time point in each group

注：與同時間點模型組比較，■P＜0.01；與同時間點假手術組比較，●P＜0.01

28 d假手術組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注10.67±0.82 10.67±1.21 10.50±1.38 10.33±1.21模型組 — 15.17±0.75● 20.33±1.03● 24.33±1.21● 16.33±1.03●醒腦通絡片組 0.28 17.83±0.75■ 40.00±1.41■ 46.00±1.26■ 19.50±1.05■醒腦通絡片組 0.56 19.00±0.89■ 43.17±1.47■ 47.33±1.21■ 24.00±1.26■醒腦通絡片組 1.12 20.17±0.75■ 44.50±1.38■ 52.00±1.41■ 24.17±1.60■

2.3 各組腦缺血再灌注各時間點Nestin陽性細胞數 結果顯示，假手術組大鼠海馬區有少數散在Nestin陽性細胞，模型組再灌注各時間點Nsetin陽性細胞數比假手術組增加，模型組和假手術組比較有顯著性差異 （P＜0.05或0.01）。醒腦通絡片各劑量組再灌注各時間點Nestin陽性細胞數比模型組增加，與模型組比較具有顯著性差異 （P＜0.05或0.01），（見表3、圖2，Nestin陽性細胞胞漿呈棕黃色，×400）。

表3 各組各時間點Nestin陽性細胞數比較Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

表3 各組各時間點Nestin陽性細胞數比較Tab.3 Com parison of Nestin positive ceIIs at each time poin t in each group

注：與同時間點模型組比較，△P＜0.05，■P＜0.01；與同時間點假手術組比較，○P＜0.05，●P＜0.01

28 d假手術組 —組別 劑量/（g.kg-1） 再灌注3 d 再灌注7 d 再灌注14 d 再灌注8.00±0.89 8.17±0.75 8.33±0.82 8.00±0.89模型組 — 9.33±0.52○ 12.00±0.63● 13.83±0.75● 11.17±0.75○醒腦通絡片組 0.28 11.83±0.75■ 14.17±0.75■ 18.17±0.75■ 12.67±0.52△醒腦通絡片組 0.56 12.50±0.55■ 16.00±0.63■ 22.00±0.89■ 14.50±0.84■醒腦通絡片組 1.12 12.67±0.52■ 20.00±0.63■ 29.83±0.75■ 16.83±0.98■

圖1 五組腦缺血再灌注14 d后缺血側海馬區BrdU染色 （×400）Fig.1 BrdU stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day with cerebraIischem iareperfusion in five groups

3 討論

腦血管病因其高發病率、高死亡率、高致殘率及高復發率的特點，已成為威脅人類健康的主要疾病之一，其中缺血性腦血管病大約占70%。急性缺血性腦血管病的治療目前主要以溶栓、改善腦循環、保護腦細胞治療為主。然而由于有限的治療時間窗，能夠早期溶栓治療的病人很少，而且腦保護劑的作用有限，因此，目前缺血性腦血管病的治療效果并不理想。神經干細胞（Neural stem cell，NSC）是指能夠分化為神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞，并具有自我更新和增殖能力的細胞［10］。分為內源性和外源性兩類，凡是來源于生物體神經系統內的為內源性NSC，而從外界導入的神經干細胞為外源性NSC。由于NSC具有不斷增殖、分裂，自我更新、自我維持，多向分化潛能等生物特性，具備神經功能修復的基礎。研究如何用NSC治療神經系統疾病成為目前的熱點。

圖2 五組腦缺血再灌注14 d后缺血側海馬區Nestin染色 （×400）Fig.2 Nestin stainings of the hippocampus ischem ia sides after the 14th day w ith cerebra I ischem iareperfusion in five groups

BrdU是胸腺嘧啶核苷的類似物，在細胞增殖周期的S期競爭摻入細胞單鏈DNA，被認為是細胞增殖的標記物。NSC發生分裂增殖后，BrdU可作為底物摻入DNA合成，用以標記增殖的NSC。研究表明，腦缺血可促進成年哺乳動物大腦SVZ區和海馬齒狀回SGZ區NSC增殖、分化、遷移，并到達損傷區取代部分壞死神經元［11-13］。Clausen等研究發現，腦缺血損傷后增殖的神經干細胞可遷移到壞死區周圍，并表達錐體細胞標志物，這些細胞可能參與修復缺損神經功能［14］。巢蛋白 （Nestin）是一種特殊的中間絲蛋白，在胚胎神經干細胞開始表達，當神經干細胞遷移、分化基本完成后，其表達便開始減弱并逐漸停止，最終被其它中間絲蛋白替代［15］。Nestin定位于細胞質，可被nestin抗體特異性識別，是早期未分化狀態神經干細胞的抗原標志，被視為NSC特異性標記蛋白，用于神經干細胞的鑒定［16］。研究顯示，大鼠腦缺血損傷后6 h，海馬區NSC開始表達nestin，7 d后達到高峰，持續時間4周［17］。近來另有研究發現，給局灶性腦缺血大鼠頸內動脈注入NSC后，NSC

能夠遷移到缺血區，并存活、分化為神經元和星形膠質細胞，神經功能恢復明顯優于單純注入NSC培養液［18］。這從另一方面說明NSC可以遷移到缺血區并分化為神經元修復神經功能。

本實驗結果顯示，醒腦通絡片能夠促進局灶性腦缺血大鼠神經功能改善，與模型組再灌注7、14、28 d比較有統計學意義 （P＜0.05或0.01）。正常成年大鼠腦組織中，海馬齒狀回SGZ區和SVZ區只有少量BrdU、Nestin陽性細胞，缺血性腦損傷后，患側上述兩區的神經干細胞發生增殖、分化。本實驗顯示，腦缺血再灌注3 d后BrdU、Nestin陽性細胞開始增加，7～14 d達到高峰，28 d明顯下降。表明缺血性腦損傷可以誘導內源性NSC增殖、分化，這與He等的研究結果相符［17］。內源性NSC在缺血性腦損傷后增殖、分化以及向損傷區遷移，說明其可能參與了受損神經組織修復，使部分喪失的神經功能得以改善。醒腦通絡片各劑量組均可使BrdU、Nestin陽性細胞增加，與同時間點模型組比較有統計學意義 （P＜0.05或0.01），說明醒腦通絡片能夠促進內源性NSC增殖、分化，提示醒腦通絡片促進局灶性腦缺血大鼠神經功能缺損改善可能與促進NSC增殖、分化有關。其具體機制有待進一步研究。

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Effect of Xingnao Tong Iuo Tab Iets on endogenous neuraIstem ceIIs in rats w ith cerebraIischem ia injury

GUO Jian-dui， TIAN Hua， HUANG Yu-juan， FANG Yu

（Shaanxi Gollege of Traditional Ghinese Medicine，Xianyang 712046，Ghina）

AIM To observe the effectof Xingnao Tongluo Tablets（XNTLT）（AstragaliRadix，Ghuanxiong Rhizoma，Persicae Semen，Garthami Flos，Spatholobi Gaulis，etc.）on endogenous neural stem cells in rats with cerebral ischemia injury.METHODS One hundred and twenty healthy SD ratswere randomly and equally divided into the sham operation control group andmodel group（physiological saline both），low，medium and high-dose XNTLT groups.Middle cerebral artery occlusionmodelwasmade by string ligation.BrdU and Nestin positive cells were observed with immunohistochemistry after ischemia-reperfusion on the 3rd，7th，14th and 28th day，respectively，prior to the assessment of eurologic function score.RESULTS Only few of BrdU and Nestin positive cells were observed in hippocampus of the sham operation group.However，the BrdU and Nestin positive cells of other four groups began to increase on the 3rd day，peaks occurred from the7th to the 14th day and decreased obviously on the 28th day after ischemia-reperfusion.Compared with themodel group，the BrdU and Nestin positive cells significantly increased in the XNTLT groups（P＜0.05 or 0.01）.The neurologic function recovered significantly in the XNTLT groups on the 14th and 28th day after ischemia-reperfusion with significant difference（P＜0.05 or 0.01）.CONCLUSION XNTLT promote the proliferation and differentiation of endogenous neural stem cells，which may be one of itsmechanisms of action in treating cerebral ischemia.

Xingnao Tongluo Tablets；cerebral ischemia injury；BrdU；Nestin；neural stem cells；proliferation

R285.5

A

1001-1528（2015）11-2352-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.11.004

2014-12-23

咸陽市科技計劃項目 ［2012k16-01（8）］

郭建隊 （1970—），男，碩士，從事中醫腦病臨床基礎研究。Tel：18691032725，E-mail：gjd1382@163.com