不同禽源坦布蘇病毒抗原相關性的測定與分析

傅秋玲，傅光華，黃 瑜，程龍飛，萬春和，施少華，陳紅梅，陳翠騰，陳 珍，林建生

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

不同禽源坦布蘇病毒抗原相關性的測定與分析

傅秋玲，傅光華，黃 瑜，程龍飛，萬春和，施少華，陳紅梅，陳翠騰，陳 珍，林建生

（福建省農業科學院畜牧獸醫研究所，福建 福州 350013）

為了比較不同禽源坦布蘇病毒（TMUV）抗原的相關性，通過細胞微量血清交叉中和試驗測定了分離自種鴨、蛋雞、肉鵝的不同禽源坦布蘇病毒之間的抗原相關值，并進行了抗原相關性分析。結果測得抗鴨源TMUV陽性血清對鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價分別為1∶1 349、1∶1 202和1∶1 318，抗雞源TMUV陽性血清對鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價分別為1∶1 023、1∶1 023和1∶977，抗鵝源TMUV陽性血清對鴨源TMUV、雞源TMUV和鵝源TMUV的中和效價分別為1∶933、1∶912和1∶955。根據親緣值（R值）（R=√r1×r2）計算公式，得出鴨源TMUV與雞源TMUV、鵝源TMUV間的抗原親緣值（R）分別為0.94和0.95，雞源TMUV與鵝源TMUV間的抗原親緣值（R）為0.91，可見3種不同禽源TMUV之間的R均大于0.7，表明三者為同一血清型的坦布蘇病毒。

坦布蘇病毒；不同禽源；抗原相關性；測定

2010年的4月以來，我國南方大部分地區種（蛋）鴨相繼發生了一種以產蛋驟降為主要特征的傳染病。研究者對該病從病毒分離、形態學觀察、理化特性測定、全基因組測序與分析和動物致病性試驗等方面開展了一系列研究，最終明確了其病原為坦布蘇病毒（Tembusu virus，TMUV）[1-5]。這幾年相繼又有種（蛋）雞、鵝、白羽半番鴨、櫻桃谷鴨、麻雀和鴿子感染TMUV的病例報道，表明該病毒的感染宿主在不斷增多，感染譜在不斷拓寬，已嚴重危害我國養禽業的健康發展[6-12]。

目前關于TMUV生物學特性、抗原性、主要毒

力和結構蛋白功能等相關研究報道較少。因此，開展對該病毒的抗原性研究不僅可揭示不同禽源TMUV的抗原相關性，還可促進疫苗研發工作進程，為禽類防治該病提供依據。

基于國內已報道鴨源、雞源和鵝源TMUV基因組之間的核酸序列和氨基酸序列的同源性均很高，分別達98.4%和98.6%以上[13]。鑒于此，這3種不同禽源TMUV的抗原相關性如何？本研究通過細胞微量交叉中和試驗明確其抗原相關性。

1 材料與方法

1.1 毒株和試驗鴨胚 WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV均由福建省農業科學院畜牧獸醫研究所分離、鑒定和保存，10日齡鴨胚（無TMUV母源抗體），購自華南生物農大生物藥品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 陽性血清抗體、陰性血清抗體的制備 陽性血清抗體是濃縮的滅活WR株鴨源TMUV、FQC1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液分別經甲醛滅活后與弗氏不完全佐劑按1∶1比例進行乳化，首次免疫成年鴨、雞和鵝，間隔2周后，與弗氏完全佐劑乳化后再次免疫，3免后采集血液制備血清，應用鴨胚成纖維細胞中和試驗法測定抗血清效價，56℃滅活后分裝凍存備用。陰性血清抗體的制備是采集自無TMUV母源抗體鴨胚孵化而得的雛鴨，56℃滅活后分裝凍存備用。

1.2.2 原代鴨胚成纖維細胞的培養 在無菌條件下取出12日齡鴨胚的胚體，置于平皿內，用小鑷子去內臟、頭、翅膀和腿等器官后將剩余的胴體放入50 mL的燒杯。用DMEM培養基漂洗3次，將剪刀剪成1 mm3左右的小塊，再用DMEM培養基漂洗3次后，棄去上清。將燒杯內的小組織塊移入錐形瓶內，加入適量的胰酶后置入37℃水浴鍋內，消化約10min至組織小塊邊緣出現毛絨狀為止。棄去胰酶，加入DMEM培養基漂洗3次，棄去上清。加入適量培養基吹打組織小塊至呈單個細胞后，將液體加入8層紗布過濾。加入完全培養基（含6%胎牛血清）稀釋至25mL后，進行活細胞計數，最后將細胞密度調整至106個/m L，加入96孔微量細胞培養板內于37℃、5%CO2培養箱靜置培養。

1.2.3 不同禽源TMUV細胞適應毒的復壯 將不同禽源TMUV鴨胚成纖維細胞適應毒接種于鴨胚成纖維細胞上，置37℃、5%CO2培養箱培養，直至出現75%的細胞病變后置-80℃冰箱凍存，反復凍融3次后收毒，病毒液分裝后標明批次，于-80℃保存備用。

1.2.4 不同禽源TMUV TCID50的測定[14]分別對WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液用不完全培養基DMEM進行10倍系列稀釋，將10-1-10-10每稀釋度按0.1mL/孔的劑量接種于使用96孔培養皿培養的原代鴨胚成纖維細胞中，37℃孵育1 h，棄去病毒液，以PBS洗滌1次后按200μL/孔加入96孔細胞培養板內，于37℃、5%CO2繼續培養1周并觀察記錄細胞病變結果，按K?rber法計算TCID50。

1.2.5 細胞微量血清中和試驗的操作程序 采用固定病毒稀釋血清法[15]。首先制備原代鴨胚成纖維細胞鋪于96孔細胞培養板內，次日將處理好的血清以滅菌PBS（pH值=7.2）進行連續梯度稀釋。以稀釋好的血清與病毒于37℃進行感作處理1 h。將感作后的病毒-血清混合液以100μL/孔的量加入已含單層細胞的96孔微量細胞培養板內，每個血清梯度接種5個孔。同時，設病毒對照、血清對照和細胞空白對照孔，均于37℃、5%CO2培養箱中靜置培養。每天觀察兩次細胞病變，記錄試驗結果。以病毒對照全部死亡及血清、PBS對照全部存活為試驗成立。按K?rber方法計算血清抗體效價。

1.2.6 細胞微量血清交叉中和試驗 首先將3種禽源TMUV陽性血清用滅菌PBS作倍比稀釋。且將含200TCID50/0.2 mL的病毒（WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV病毒液）分別與不同稀釋度的陽性血清等量混合，于37℃孵育1 h。其他步驟按照1.2.5進行操作。

1.2.7 判定標準 參照口蹄疫病毒血清型和亞型的區分標準進行判定[15]，由異源血清與同源血清效價之比得到2個比值（r1和r2），再根據公式親緣值（R值）：R=√r1×r2計算得出。

2 結果

2.1 不同禽源TMUV TCID50的測定按K?rber方法計算出WR株鴨源TMUV、FQ-C1株雞源TMUV和GD06株鵝源TMUV的TCID50值分別為105.96/0.1 mL、105.69/0.1mL、105.62/0.1mL。

2.2 細胞微量交叉中和效價及R值 采用固定病毒（200TCID50/0.2mL）稀釋血清法對鴨源、鵝源和雞源TMUV進行細胞微量交叉中和試驗。利用交叉中和抗體效價按公式計算兩種間的親緣值（R值）（表2），結果顯示，WR株鴨源TMUV與FQC1株雞源TMUV、WR株鴨源TMUV與GD06株鵝源TMUV和FQ-C1株雞源TMUV與GD06株鵝源TMUV的R值分別為0.94、0.95和0.91。因此，不同禽源TMUV的R值都大于0.7，表明3種不同禽源TMUV處于同一種血清型。

表1 不同禽源TMUV與相應血清交叉中和試驗

表2 不同禽源TMUV毒株間R值

3 討論與結論

坦布蘇病毒是黃病毒（Flaviviridae）黃病毒屬（Flavivirus）的坦布蘇病毒成員，其基因組全長約為10 278 nt，編碼3 425個氨基酸的多聚蛋白前體，由3種結構蛋白（衣殼蛋白C、膜前體蛋白M和包膜蛋白E）和7種非結構蛋白（NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5）組成[16]。自2010年以來，我國研究發現不同禽源的坦布蘇病毒全基因組核苷酸的同源性很高[16]。本研究選用的FQ-C1株雞源TMUV與2010年后分離的TMUV全基因組核苷酸的同源性均達98%以上，與WR株鴨源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性都達99.2%，與鵝源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性亦達99%和98%以上[12]；WR株鴨源TMUV與鵝源TMUV全基因組核苷酸和氨基酸同源性也為99%以上[17]，且GenBank中近幾年公布TMUV各分離株間的序列無宿主來源或分離地點的特性差異[12]。

本研究利用細胞微量血清交叉中和試驗測定了不同禽源的抗原相關值，結果顯示，3株不同禽源TMUV之間的R值都達0.9以上，均大于0.7，表明這3種不同禽源的TMUV不存在抗原性差異，為同一血清型坦布蘇病毒，與基因組核苷酸同源性高的結果相一致。

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Identification and analysis of the antigenicity of Tembusu virus from different avian

FUQiu-ling，FUGuang-hua，HUANG Yu，CHENG Long-fei，WAN Chun-he，SHIShao-hua，CHEN Hong-mei，CHEN Cui-teng，CHEN Zhen，LIN Jian-sheng
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Fujian Academy of Agricultural Science，Fuzhou 350013，China）

In order to study the antigenicity of different avian Tembusu viruses isolated from breeding duck，laying hen，and meat goose，serum cross cellmicro-neutralization testwas employed to analyze the antigenicity of the viruses.The results of serum cross neutralization test showed that the neutralization titers of reaction between sera against TMUV from ducks and different avian Tembusu viruseswere 1∶1349，1∶1202 and 1∶1318，respectively.The neutralization titers of reaction between sera against TMUV from chickens and differentavian Tembusu viruseswere 1∶1023，1∶1023 and 1∶977，respectively.The neutralization titers of reac?tion between seras against TMUV from geese and different avian Tembusu viruseswere 1∶933，1∶912 and 1∶955，respectively.Ac?cording to the relative value（R value）calculation formula（R=√r1×r2），the R value between TMUV from ducks and TMUV from chickens or TMUV from geese were 0.94 and 0.95，and the R value between TMUV from chickens and TMUV from geese was 0.91，which was more than 0.7.The results indicate that the three different avian Tembusu viruses belong to the same sero-sub?type，and the crossprotectionsexistamong them.

Tembusu virus；differentavian；antigenicity；identification

HUANG Yu

S852.65

A

0529-6005（2015）11-0030-03

2015-06-11

現代農業產業技術體系建設專項資金資助（CARS -43）；國家自然科學基金項目（31201936）；福建省優良蛋鴨品種與設施化養殖創新產業化工程項目；福建省農業科學院科研項目（2013DQB-3）；福建省農科院“雙百”行動項目（sbmx1507-3）

傅秋玲（1985-），女，研究實習員，碩士，研究方向為預防獸醫免疫，E-mail：qiulingfu0822@163.com

黃瑜，E-mail：huangyu_815@163.com