DSS誘導血管內皮細胞ECV304凋亡及機制研究

張宸豪，陳 為，王月華，李 強，李 妍

（吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013）

DSS誘導血管內皮細胞ECV304凋亡及機制研究

張宸豪，陳 為，王月華，李 強，李 妍

（吉林醫藥學院檢驗學院，吉林 吉林 132013）

為了研究葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導血管內皮細胞ECV304增殖和凋亡的影響。體外培養血管內皮細胞ECV304，采用不同濃度DSS誘導細胞，流式細胞術分析細胞凋亡、活性氧（ROS）、線粒體膜電位（MMP）、細胞周期；WST-1法檢測細胞增殖抑制率。結果顯示，隨著DSS濃度的增加細胞凋亡率增加，并導致細胞GOG1期阻滯，細胞內活性氧含量減少，同時線粒體膜電位下降，細胞增殖抑制率明顯升高。結果表明，DSS可以抑制血管內皮細胞ECV304增殖并誘導細胞凋亡。

DSS；凋亡；血管內皮細胞

炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）是一組病因不明的慢性腸道炎癥性疾病[1]。在人類表現為兩種獨立的疾病，潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）和克羅恩?。–rohn's disease，CD），雖然IBD發病機制還尚不明確，但環境因素、遺傳因素、腸道菌群失調和機體免疫功能失調在IBD發病機制中占有重要地位[2]。葡聚糖硫酸鈉（Dextran Sulfate Sodium，DSS）是一種人工合成的硫酸多糖體，具有和肝素同樣的抗止血及抗凝血作用，其誘導的小鼠腸道損傷是人類炎性腸病的最常用的實驗性動物模型[3]，近年來有學者認為，腸道黏膜血管內皮損傷和局部免疫細胞活化在IBD進程中具有重要作用[4]，但尚無文獻報道DSS對血管內皮細胞是否有損傷作用，以及損傷血管內皮細胞的機制也未見報道。因此，本研究以體外培養的血管內皮細胞ECV304為模型，用不同濃度的DSS處理細胞，分析細胞增殖、凋亡、活性氧和線粒體膜電位變化。進一步揭示其損傷機制，這對研究IBD發生機制及藥物篩選均有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料 人ECV304血管內皮細胞，購自中國科學院上海細胞所；1640培養液，購自Gibco公司；小牛血清，購自Hyclone公司；PI和Annexin-V-FITC細胞凋亡試劑盒，購自eBiocience公司。JC-1線粒體膜電位（mitochondrialmembrane potential，MMP）檢測試劑盒（產品編號C2006）和ROS熒光探針雙氯熒光黃乙酸乙酯（Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA），購自上海碧云天生物技術研究所；DSS，購自Sigma公司。流式細胞儀型號為Epics XL（美國貝克曼公司）。

1.2 細胞培養和處理 試驗前1周，自液氮中取出凍存的細胞，復蘇后在如下條件下培養：含10%小

牛血清1640培養液、5%CO2、飽和濕度和37℃。2～3 d傳代1次，取對數生長期細胞用于試驗。按如下分組加入DSS制劑：DSS0，200，400，800，1 600 μg/mL和3 200μg/mL誘導細胞24 h進行ROS和凋亡檢測，或采用DSS 0，200，800μg/mL和3200μg/ mL作用24 h，收集細胞進行線粒體膜電位和細胞周期分析，DSS 0，200，800μg/mL和3 200μg/mL作用72 h，收集細胞進行增殖試驗。

1.3 ROS檢測 取5×105個細胞，PBS洗滌2次，100μL PBS重懸細胞，加入DCFH-DA儲存液，至其終濃度為5μmol/L，混勻后在37℃避光反應30min，PBS洗2次后流式細胞儀分析。

1.4 細胞凋亡分析 取5×105個細胞，用PBS洗滌2次，取195μL結合緩沖液重懸細胞，加入5μL FITC-標記Annexin-V，室溫下避光反應30min；結合緩沖液洗滌細胞2次，400μL結合緩沖液重懸細胞，加入PI溶液5μL，5min后用流式細胞儀分析。

1.5 線粒體膜電位分析 取5×105個細胞，參考試劑盒說明書提供的方法，配制JC-1染色工作液和染色緩沖液（冰沐保存）。500μL JC-1染色工作液重懸細胞，37℃避光反應30min；離心后棄上清，染色緩沖液洗滌細胞2次；500μL染色緩沖液重懸細胞，流式細胞儀FL1通道（525 nm）檢測細胞所發射的熒光。

1.6 細胞周期分析 預冷PBS洗細胞兩次，之后用80%預冷乙醇固定細胞，-20℃保存過夜，上機檢測前調細胞濃度為1×107個/mL，取100μL細胞懸液加入400μL含有0.01 g/LPI，20×106mol/L的RNase A和0.02%Triton-X100的PBS，室溫閉光處理30min后，流式細胞術檢測細胞周期，并采用SubG1法分析凋亡細胞百分率。

1.7 細胞增殖分析 接種細胞于96孔細胞培養板，加DSS至不同濃度（0，200，800μg/mL和3 200μg/ mL），每個處理因素設3個復孔。繼續培養72 h，每孔加入WST-1溶液10μL，37℃培養2 h后，用酶聯檢測儀分析450 nm的吸光度值。用3次獨立試驗的數據，計算不同濃度DSS對ECV304細胞增殖的抑制率（IR）。

1.8 統計學分析 以3次試驗的平均值±標準差來表示最終結果。組間均數的比較采用t檢驗，用SPSS15.0軟件做統計分析,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 用DSS對血管內皮細胞ROS的影響 0，200， 400，800，1 600μg/mL和3 200μg/mLDSS處理細胞24 h，流式細胞術分析細胞內活性氧（圖1），結果表明，細胞內ROS隨濃度增加而降低（表1）。

圖1 DSS對血管內皮細胞ROS的影響

表1 DSS對血管內皮細胞ROS的影響

2.2 DSS對血管內皮細胞凋亡的影響 PI和FITC-Annexin-V雙染法分析細胞凋亡，圖中左下，左上，右上和右下象限分別代表活細胞，壞死細胞，晚期凋亡和早期凋亡細胞（圖2）；凋亡細胞（含早期凋亡和晚期凋亡）百分率隨濃度增加而增加（表1）。

圖2 DSS對血管內皮細胞凋亡的影響

2.3 DSS對血管內皮細胞線粒體膜電位的影響

JC-1是一種新型熒光探針，進入細胞后，其存在狀態和發射熒光與線粒體功能緊密聯系。線粒體功能正常時，JC-1主要聚集在線粒體基質，形成聚合物，發射紅色熒光；而在MMP較低時，JC-1主要以單體形式存在，發射綠色熒光（圖3）；與對照組比較，JC-1單體的綠色熒光逐漸增加（圖3），即DSS以濃度依賴的方式導致MMP下降。

圖3 DSS對血管內皮細胞線粒體膜電位的影響

2.4 DSS對血管內皮細胞周期增殖的影響 PI染色和流式細胞術分析細胞周期，與對照組比較，200，800μg/mL和3 200μg/mL的DSS導致G2/M期細胞減少，G0G1期細胞增加；凋亡細胞（SubG1期細胞）出現（圖4）。

圖4 DSS對血管內皮細胞周期的影響

2.5 DSS對血管內皮細胞增殖的影響 DSS處理細胞72 h，200，800μg/mL和3 200μg/mL DSS對血管內皮細胞的抑制作用隨著濃度的增加而增加（見圖5）。

圖5 DSS對血管內皮細胞增殖的抑制作用

3 討論

癌癥是導致人類死亡的主要原因之一，而約1/ 4癌癥病例的病因和發病機制與感染和慢性炎癥相關[5]。炎癥性腸?。↖BD）是一類病因和發病機制未明的腸道炎癥性疾病，其發病率且呈逐年上升和年輕化趨勢；IBD患者發生結直腸癌（colorectal cancer，CRC）的風險率增高[5-6]。葡聚糖硫酸鈉（dextran sodium sulfate，DSS）誘發的結腸炎相關性癌癥（colitis associated cancer，CAC）動物模型由于成功地模擬IBD誘發CRC的全過程，被廣泛用于研究IBD相關性CRC的癌變機理，闡明其病理變化與癌變原理有助于發現結直腸癌治療新的候選靶點。

化學致炎劑DSS是一種人工合成的硫酸鹽多糖，小鼠經飼喂含有DSS的飲水可以形成炎癥性腸病模型（DSS模型）。其病理改變接近人類UC，往往出現以血便、腸道黏膜潰瘍和粒細胞浸潤為特征的結腸炎癥。DSS的致炎機制尚未闡明，可能與DSS攜帶的負電荷影響DNA合成、抑制上皮細胞增生、破壞腸黏膜屏障、導致巨噬細胞功能障礙及腸道菌群失調有關[7-9]。近期研究表明，腸道局部血管內皮細胞和免疫細胞在IBD進程中具有重要作用，但尚無文獻報道DSS對血管內皮細胞是否有損傷作用，以及影響血管內皮細胞的機制也未見報道。為此本研究以體外培養的血管內皮細胞為模型，用不同濃度的DSS處理細胞，分析細胞增殖、凋亡、活性氧和線粒體膜電位。研究發現，DSS可顯著誘導內皮細胞凋亡、抑制其增殖，并導致細胞GOG1期阻滯，具有劑量依賴性。DSS對細胞內ROS產生有抑制作用，抑制效應隨DSS濃度增大而增大。雖然高濃度的ROS本身是過氧化導致細胞損傷的重要因素，但ROS也是細胞正常生長期線粒體功能的重要產物，一定濃度的ROS是細胞內源的“生長因子”。本研究發現，DSS抑制ROS的同時，細胞線粒體膜電位也顯著下降，線粒體膜功能受損，凋亡細胞增加，所以DSS可以通過抑制血管內皮細胞ROS產生和增殖誘導細胞凋亡。

[1]涂夢瑩，宋麗君.炎癥性腸病的診斷與治療進展[J].實用兒科臨床雜志，2012，27（7）：552-556.

[2]林勇，張德純.潰瘍性結腸炎的微生態學研究現狀與展望[J].中國微生態學雜志，2002，14（4）：1199-1203.

[3]徐麗紅，肖芳，蘭小琴，等.葡聚糖硫酸鈉誘導C57BL/6J小鼠急性結腸炎模型的建立與評價[J].醫學研究生學報，2014，27（9）：918-922.

[4]Punit S，DubéPE，Liu C Y，etal.Tumor Necrosis Factor Receptor 2 Restricts the Pathogenicity of CD8+TCells in Micewith Colitis[J]. Gastroenterology，2015，S0016-5085（15）：00820-00823.

[5]何曉生，陳澤賢，蘭平.炎癥性腸病癌變研究進展[J].中國實用外科雜志，2013，33（7）：604-606.

[6]陳曦，楊世忠.炎癥性腸病動物模型的研究進展[J].中國老年學雜志，2007，13（27）：1326-1328.

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[9]Maltby S，Wohlfarth C，Gold M，et al.CD34 is required for infi ltrationof eosinophils into the colon and pathology associatedwith DSS-induced ulcerative colitis[J].Am JPathol，2010，177：1244-1254.

Study on theM echanism of ECV304 Apoptosis Induced by DSS

ZHANGChen-hao，CHENWei，WANG Yue-hua，LIQiang，LIYan
（DepartmentofMedical laboratory，Jilin MedicalCollege，Jilin 132013，China）

The objective of this studywas to investigate the influence of DSSon proliferation and apoptosis in endothelial cells（ECV304）.Different concentrations of DSSwere used to treat ECV304 cells in vitro.Apoptosis，reactive oxygen species（ROS），mitochondrial transmembrane potential（MMP）and cell cycle were analyzed by flow cytometry（FCM），and cellular proliferation in?hibition rate wasmeasured by WST-1.The results showed thatwith the rising concentration of DSS，apoptosis rate and the percent?ageof cellsofG0G1 increased,intracellular reactiveoxygen contentandmitochondrialmembrane potentialdecreased,and the prolif?eration inhibition rate was significantly increased.DSS can inhibit proliferation of ECV304 and induce apoptosis.

DSS；apoptosis；EndothelialCells

LIYan

R 363

A

0529-6005（2015）11-0039-03

2015-07-07

吉林省科技廳中青年科技創新領軍人才及團隊項目（20130521018JH）；吉林省教育廳十二五"科學技術研究（吉科教合字[2012]第487號）；吉林省衛生廳項目（2013Z09-1）；吉林市科技計劃項目（201133101）

張宸豪（1972-），男，副教授，博士，從事抗感染免疫的機制研究，E-mail：zhangchenhao0618@163.com

李妍，E-mail：liyan@jlmpc.cn