杜仲注射液的制備及安全性試驗

趙微微，武 瑞，吳國軍，王翠媛，于德斌，梁建斌，李啟濤

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

杜仲注射液的制備及安全性試驗

趙微微，武 瑞，吳國軍，王翠媛，于德斌，梁建斌，李啟濤

（黑龍江八一農墾大學動物科技學院，黑龍江 大慶 163319）

為了制備杜仲注射液，并對其安全性進行評價，通過單因素試驗對附加劑最適用量范圍進行研究，應用L9（3）4正交試驗方法研究注射液配方最佳用量，采用單因素試驗對活性碳用量、吸附時間以及吸附溫度進行確定；根據熱原檢查法、異常毒性試驗檢查法、過敏性試驗檢查法以及溶血和凝聚試驗檢查法對杜仲注射液的安全性進行評價。結果：最佳制備工藝為在杜仲葉提取液中加入0.14%亞硫酸氫鈉（W/V）、0.05%吐溫-80（V/V）和0.2%藥用活性炭（W/ V），45℃吸附25min，過濾，分裝，灌封；杜仲注射液符合安全性試驗檢查規定。

杜仲注射液；制備工藝；安全性

杜仲（Eucommia ulmoidesOlive）在我國已有2000多年的用藥歷史，《神農本草經》和《本草綱目》中均有記載，被列為上品。杜仲葉與杜仲皮含有綠原酸、杜仲酸、多糖、珊瑚苷以及黃酮類等相似活性成分，其具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、增強免疫力以及抗氧化等多種藥理作用[1-4]?！吨袊幍洹罚?005版）確定綠原酸為杜仲葉主要藥用有效成分和含量檢測標準[5]。杜仲葉提取液在畜牧生產中應用廣泛，但多為散劑，影響療效。本試驗旨在制備一種杜仲注射液，并對其進行安全性評價。

1 試驗材料

1.1 試驗材料與動物 綠原酸標準品（中國食品藥品檢定研究院）；乙醇（天津市永大化學試劑有限公司）；氫氧化鈉（天津市光復科技發展有限公司）；吐溫-80（天津市瑞金特化學品有限公司）；亞硫酸氫鈉（天津市致遠化學試劑有限公司）；明膠（天津市復興精細化工研究所）；藥用活性炭（上海寶曼生物科技有限公司）；家兔、小鼠、豚鼠（長春生物制品研究所）。

1.2 試驗儀器 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent）；DK-S12型恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器有限公司公司）；DRP-9272型電熱恒溫培養箱（上海森信實驗儀器有限公司）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；RE52-99旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠）；SH2-Ⅲ循環水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；實驗室pH計FE20（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高效液相色譜法繪制綠原酸標準曲線 色譜條件：色譜柱為Sepax Bio-C18（250 mm×4.5 mm，5μm，美國Sepax公司）；流動相為88%A（磷酸緩沖液，0.03mol/L，pH值=4.71），12%B（乙腈）；流速為1.00mL/min；柱溫為28℃；UV檢測波長為328 nm；進樣量為10μL。

綠原酸標準液制備：精密稱取綠原酸標準品15mg，加入注射用水使其充分溶解，制成綠原酸標準液15 mg/mL，再用注射用水稀釋成不同濃度備用，以綠原酸含量（mg）為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制綠原酸標準曲線。

1.3.2 杜仲注射液的制備 （1）杜仲葉提取液的前處理：取杜仲葉提取液適量，適度濃縮后加入乙醇，使藥液乙醇濃度為75%，4℃避光靜止24 h，3000 r/min離心20min，過濾，回收乙醇，將藥液濃縮至1.5 g/mL。向濃縮后的藥液中加入4%明膠，至不再產生沉淀為止，避光靜止30 min，加入乙醇，使藥液乙醇濃度為85%，4℃避光靜止24 h，3 000 r/min離心30min，過濾，回收乙醇，將藥液濃縮至1 g/mL，備用；（2）亞硫酸氫鈉、吐溫-80常用范圍分別為0.05%～0.25%（W/V），0.04%～0.15%（V/ V），pH值常用范圍為4～9，本試驗采用單因素試驗對亞硫酸氫鈉、吐溫-80用量以及注射液pH值適合范圍進行篩選。以單因素試驗結果為依據，應用正交試驗確定最適亞硫酸氫鈉、吐溫-80用量和pH值，通過綠原酸含量、注射液顏色和澄明度進行評價，評價標準如表1，總分數=峰面積/ 100＋外觀得分；（3）采用單因素試驗對藥用活性炭用量[0.1%、0.2%、0.3%、0.4%（W/V）]、吸附溫度（30℃、45℃、60℃、75℃、90℃）、吸附時間（15 min、25min、35 min、45min）進行確定，通過綠原酸含量和透光率進行評價；（4）根據《中國獸藥典》（2010版二部附錄）安全性檢查法，對杜仲注射液安全性進行評價。見表1。

表1 外觀評分標準

2 試驗結果與分析

2.1 高效液相色譜法繪制綠原酸標準曲線 回歸方程為y=142.99x+85.123，R2=0.9977（n=6），其中x為綠原酸含量（mg），y為綠原酸峰面積，由此可知綠原酸含量在2.5～15mg范圍內具有良好的線性關系。見圖1。

圖1 綠原酸標準曲線

2.2 附加劑篩選結果 單因素試驗結果表明，最佳的亞硫酸氫鈉用量范圍為0.14%～0.16%，吐溫-80用量范圍為0.05%～0.06%，最適pH值范圍為5～6。正交試驗因素及水平見表2，試驗結果顯示pH值對試驗影響最大，亞硫酸氫鈉次之，最適配方為0.14%亞硫酸氫鈉，0.05%吐溫-80，pH值為5。見表2。

表2 正交試驗因素與水平考察

2.3 脫色條件選擇結果 通過對綠原酸含量和透光率兩方面的綜合考慮，結果顯示，當脫色條件為0.2%的藥用活性炭，45℃吸附25min效果最佳。

2.4 安全性試驗結果

2.4.1 熱原檢查結果 3只家兔體溫升高溫度均低于0.6℃，且體溫升高總和為0.5℃，低于1.3℃，符合《中國獸藥典》（2010二部附錄）熱原檢查的規定。

2.4.2 異常毒性檢查結果 以靜脈注射、腹腔注射、皮下注射以及口服給藥的20只試驗小鼠在48 h內未出現死亡，符合《中國獸藥典》（2010二部附錄）異常毒性檢查法的規定。

2.4.3 過敏試驗 6只試驗豚鼠在給藥30min后未出現豎毛、發抖、干嘔、連續噴嚏3聲、連續咳嗽3聲等過敏現象，符合《中國獸藥典》（2010二部附錄）過敏性試驗規定。

2.4.4 溶血與凝血試驗 1、2號管上清液有色澄明且上清液顏色與5號試管無明顯差異，紅細胞全部下沉，3 h內未出現溶血和凝聚，符合《中國獸藥典》（2010版二部附錄）溶血與凝聚檢查法的規定。

3 討論

徐北平研究發現，抗氧化劑對綠原酸的降解有一定抑制作用，其中亞硫酸氫鈉效果最好[6]。而亞硫酸氫鈉常用濃度為0.05%～0.2%，試驗結果表明，藥液亞硫酸氫鈉濃度為0.14%效果最好；常用的中藥增溶劑有吐溫-80和膽酸鹽，其中膽酸鹽適合pH值在6以上的中藥注射液，pH值在6以下時，膽酸易析出；而吐溫-80是注射液中用的較多的增溶劑，常用濃度為0.04%～0.2%，試驗結果表明，藥液吐溫-80濃度為0.05%時得分最高；注射液pH值一般在4～9之間，如果血液中pH值忽然過高或過低，則會危害細胞代謝，危及生命。試驗結果顯示，pH值為5時綜合評分最高。

杜仲葉提取液中含有很多有色物質，顏色較深，影響注射液的顏色，活性炭可將有色物質吸附在表面上，從而達到脫色的作用。同時，活性炭吸附法還能起到除熱原的作用?；钚蕴课椒ㄔ诿撋臀綗嵩耐瑫r，也會吸附一些藥物成分，應注意活性炭用量、吸附時間和吸附溫度等因素，試驗結果表明，活性炭用量、吸附時間和吸附溫度超過一定值時對綠原酸含量都有一定影響，而對透光率影響不大。因此選擇0.2%藥用活性炭，45℃吸附25min，吸附后0.45μm微孔濾膜粗濾，0.20μm微孔濾膜精濾。

4 結論

綜上所述，本試驗成功制備了杜仲注射液，其符合《中國獸藥典》（2010版二部附錄）安全性檢查規定。

[1]秦國利.淺談杜仲的化學成分及藥理作用[J].中醫中藥，2012，10（26）：613-614.

[2]彭紅梅，李小姝.杜仲的藥理研究現狀及應用展望[J].中醫學報，2013，28（176）：72-73.

[3]王志宏，彭勝，雷明盛，等.杜仲主要生物活性研究進展[J].天然產物研究與開發，2013，25：1302-1309.

[4]Ohrishi M.Inhibitory effects of chlorogenic acids on linoleicacid peroxide ation and haemolysis[J].phytochemistry，1994，36（3）：576-583．

[5] 國家藥典委員會.中國藥典[S].2005版一部：114.

[6]徐北平.杜仲葉中高純度綠原酸的提取及穩定性研究[D].南昌：南昌大學，2012.

[7] 中國獸藥典委員會.中國獸藥典[S].2010版二部，附錄：176.

S853.7

B

0529-6005（2015）11-0070-02

2014-06-25

趙微微（1989-），女，碩士，從事中獸藥開發研究，E-mail：821320288@qq.com

武瑞，E-mail：fuhewu@126.com