3-甲基-4-硝基酚對大鼠腎臟氧化損傷作用的研究

岳 卓，常玲玲，許方倩偉，佘銳萍

（1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 朝陽 100024；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；3.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；4.中國生物技術股份有限公司科研與國際合作部，北京 朝陽 100029）

3-甲基-4-硝基酚對大鼠腎臟氧化損傷作用的研究

岳 卓1，2，常玲玲2，3，許方倩偉4，佘銳萍2

（1.北京天壇生物制品股份有限公司，北京 朝陽 100024；2.中國農業大學動物醫學院，北京 海淀 100193；3.西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100；4.中國生物技術股份有限公司科研與國際合作部，北京 朝陽 100029）

為了探討3-甲基-4-硝基酚（PNMC）對大鼠腎臟的氧化損傷作用，選擇SPF級雄性SD大鼠，隨機分為4組（每組10只），設立3個染毒組和1個對照組。染毒組采用皮下注射的途徑分別給予每天劑量為1mg/kg體重、10mg/kg體重和100mg/kg體重的PNMC，連續5 d。對照組采用同樣的途徑給予溶劑（PBS+0.05%tween80），最后一次染毒后第24小時剖檢取材。稱量體重和器官重量，觀察腎臟組織病理學變化，檢測血清中肌酐和尿素氮的含量，以及超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶、總抗氧化能力及丙二醛等抗氧化指標的含量。結果顯示，染毒組大鼠體重和日增重出現不同程度的下降；各劑量組大鼠腎臟均有不同程度的病理損傷；100mg/kg體重組大鼠肌酐濃度顯著升高，所有染毒組大鼠超氧化物歧化酶的含量均顯著下降，10mg/kg體重染毒組大鼠總抗氧化能力也顯著低于對照組。綜上所述，PNMC染毒后血清中超氧化物歧化酶的活性降低，同時伴有總抗氧化能力下降，提示大鼠體內抗氧化系統遭到破壞，導致過多的過氧化物在體內蓄積，從而對大鼠腎臟造成氧化損傷。

3-甲基-4-硝基酚；SD大鼠；腎臟；氧化損傷

3-甲基-4-硝基酚（PNMC）是柴油機尾氣的重要組織成分，也是殺蟲劑殺螟松在生物體內的主要降解產物。研究表明，隨著柴油機尾氣的大量排放和農藥的廣泛使用，PNMC不斷地在環境中蓄積，通過呼吸道、消化道、皮膚等途徑進入人及動物體內，嚴重威脅動植物乃至人類的健康[1-2]。

現有研究已經證實，氧化應激（OS）是外源性物質產生毒性作用最基本的分子機制[3-4]。它主要是由活性氧和脂質過氧化物介導生物大分子和脂膜產生自由基，引起氧化損傷和細胞死亡[5]。有報道表明，PNMC可以引起雞胚精原細胞產生OS[6]，而且當暴露于柴油機尾氣中時可引起OS[7]，這些結果提示，OS可能是PNMC產生毒性作用的重要發病機制。我們前期研究證明，PNMC可損傷大鼠腎臟的形態結構[8]，本研究中，我們擬探討PNMC誘導腎臟損傷與OS之間的關系，為揭示PNMC誘導的腎臟損傷的發病機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及飼養 體重160～180 g SPF級 SD雄性大鼠40只，購自中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心，分籠飼養（2～3只/籠），自由飲食。飼養環境：室溫21℃～24℃，相對濕度：30%～40%，每兩天更換1次墊料。大鼠對飼養環境適應1周后進行染毒試驗。大鼠隨機均分為4組，3個染毒組和1個對照組。其中染毒組分別是1mg/kg體重、10mg/kg體重和100mg/kg體重劑量組,每天采用皮下注射的途徑進行染毒，連續進行5 d，對照組皮下注射等量的溶劑（PBS+ 0.05%tween80）。每天觀察大鼠的活動情況并稱重。最后1次染毒后第24小時，無痛處死大鼠,采血并分離血清備用，摘取兩側的腎臟，稱量器官濕重并計算其臟器系數（腎臟濕重/體重），右側腎臟液氮冷凍備用，左側腎臟用2.5%多聚甲醛-戊二醛固定液充分固定備用。

1.2 組織病理學觀察 腎臟組織塊經固定液充分固定后，按常規方法進行脫水、透明和石蠟包埋，制作成厚度為4μm的連續切片，進行蘇木素-伊紅（H.E.）染色，OLYMPUS顯微鏡進行觀察，拍照。

1.3 血清中肌酐和尿素氮水平的測定 為了評價腎臟功能，利用肌酐（Cre）測試盒和尿素氮（BUN）測試盒（均購自南京建成生物工程研究所）檢測血清中的Cre和BUN的水平變化。具體

方法按照試劑盒說明書進行操作。

1.4 血清和組織中抗氧化水平的測定 為評價機體抗氧化能力，利用超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、總抗氧化能力（TAOC）和丙二醛（MDA）等試劑盒（均購自南京建成生物工程研究所）分別檢測了血清和腎臟組織中SOD、GSH-Px、T-AOC及MDA等抗氧化指標的活性。具體方法按照試劑盒說明書進行操作。

1.5 數據處理和統計 數據處理采用SPSS12.0軟件進行方差分析和顯著性差異檢驗。數據表達方式以“平均值±標準差”表示，P＜0.05表示與對照組相比差異顯著。

2 結果

2.1 PNMC對大鼠體重和腎臟重量的影響 由表1可知，SD大鼠經PNMC染毒5 d后，各劑量組大鼠體重及日增重均顯著低于對照組（P＜0.05），但是腎臟的相對重量與對照組相比并無顯著性差異（P＞0.05）。

表1 PNMC對大鼠體重及腎臟重量的影響

2.2 PNMC對大鼠腎臟組織形態結構的影響 組織病理學觀察結果（見中插彩版圖1）顯示，對照組大鼠腎臟腎小管上皮細胞排列緊密、有序，刷狀緣清晰、致密（見中插彩版圖1A），而PNMC染毒組大鼠腎臟均出現了不同程度的損傷：經1mg/kg體重和10mg/kg體重劑量的PNMC處理的大鼠腎臟近曲小管的刷狀緣溶解消失（見中插彩版圖1B、圖1C），經10mg/kg體重和100mg/kg體重劑量的PNMC處理的大鼠腎臟皮質和髓質的腎小管上皮細胞出現不同程度的壞死，細胞核固縮凝聚，且髓質部的壞死程度較皮質部嚴重（見中插彩版圖1C、圖1D）。腎小管上皮細胞死亡的特點與我們以前研究所描述的壞死損傷特點基本一致[8]。

2.3 PNMC對大鼠血清中肌酐和尿素氮水平的影響 血清學分析結果（圖2）顯示，與對照組相比，經PNMC染毒后，大鼠血清BUN水平并沒有明顯變化，大鼠血清Cre水平在1mg/kg體重和10mg/ kg體重PNMC劑量組也只是略有升高，但是在100mg/kg體重PNMC劑量組大鼠血清肌酐的濃度卻顯著升高（P＜0.05）。

2.4 PNMC對SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響 血清中抗氧化指標檢測結果（見表2）顯示，染毒組大鼠血清中SOD濃度與對照組比較均顯著下降（P＜0.05）；血清中T-AOC的含量在10mg/kg體重PNMC染毒組也顯著低于對照組（P＜0.05）；染毒組大鼠血清GSH-Px濃度略有降低，MDA濃度略有升高，但與對照組比較差異不顯著（P＞0.05）。

表2 PNMC對大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響

圖2 PNMC對大鼠血清肌酐和尿素氮水平的影響注：大鼠經PNMC染毒后，與對照組相比，100mg/kg體重劑量組血清中肌酐水平顯著升高，各劑量組尿毒氮水平與對照組相比未見有明顯差異P＞0.05；*：與對照組相比有顯著差異性，P＜0.05，n=10

腎臟組織中抗氧化指標檢測結果見表3，與血清檢測結果不同，PNMC染毒后大鼠腎臟組織中的SOD、GSH-Px和T-AOC的濃度與對照組比較稍有下降，但差異不顯著；同樣，PNMC染毒后大鼠腎臟組織中MDA的含量與對照組比較稍有升高，但差異也不顯著（P＞0.05）。

表3 PNMC對大鼠腎臟組織中SOD、GSH-Px、T-AOC和MDA活性的影響

3 討論

PNMC可通過呼吸道、消化道及皮膚進入動物機體，因此本研究選用皮下注射的方式對大鼠進行染毒。已有研究表明，經PNMC染毒的大鼠增重及器官重量均下降[9]。在本研究中，PNMC染毒后大鼠的體重和平均日增重也顯著下降。然而，Li等[10]采用同樣的染毒方式未發現PNMC對大鼠體重有明顯的影響，這可能歸因于選用了不同品系的大鼠，而本研究結果提示SD大鼠對PNMC更為敏感。

剖檢結果顯示，PNMC染毒組小鼠沒有出現明顯的大體病變，但是，在100 mg/kg體重PNMC組發現血清中Cre濃度顯著升高。血清中Cre濃度是評價腎臟功能的一個常用指標，其濃度升高意味著腎臟功能出現損傷。因此，本研究結果表明，PNMC可以損傷腎臟功能。病理組織學觀察結果進一步證明了PNMC對腎臟形態結構的破壞作用。染毒組大鼠腎小管上皮細胞發生壞死，主要位于腎臟的皮髓交界處和髓質部，而且隨著染毒劑量的增加，壞死細胞數量也增加，呈現明顯的劑量相關性。研究表明，PNMC具有擴張血管的作用[11-12]，可造成大鼠腎臟缺血應激，而且腎臟髓質血流量少于皮質，所以髓質區腎小管上皮細胞的病變程度高于皮質區。以上結果表明，PNMC對大鼠腎臟具有毒性作用。

在正常情況下，機體產生的活性氧簇（ROS）的清除有賴于抗氧化酶系統（SOD、GSH-Px和/或過氧化氫酶）和非酶類抗氧化劑（如：谷胱甘肽、維生素E）[13-15]。當這個系統的平衡被破壞，即自由基產生過多和（或）抗氧化防御能力下降，就會造成氧化損傷，自由基可以直接和脂質、蛋白以及DNA反應造成不可逆的損傷，最終導致細胞死亡[16-17]。另外，自由基還可以與存在于細胞膜上的很對不飽和脂肪酸以及膽固醇反應，隨后引起細胞凋亡[18]。Donaldson等[19]的研究表明，DEP可以引起小鼠肺臟產生ROS，造成蛋白質氧化、脂質氧化和DNA損傷。在本研究中，大鼠連續5 d皮下注射不同濃度的PNMC后，血清中SOD的含量顯著下降，這一結果與PNMC在雞胚精原細胞的試驗結果一致[6]；而且血清中T-AOC的含量在10mg/kg體重PNMC染毒組也顯著低于對照組，這些結果表明血清中抗氧化酶的活性降低。然而，腎臟組織中的SOD、GSH-Px和T-AOC的含量稍有下降，但與對照組比較差異不顯著，同樣，MDA的含量也沒有明顯變化，表明腎臟組織中的抗氧化酶的活性并未受到影響。綜上，PNMC染毒后血清中SOD活性降低同時伴有T-AOC的下降，提示大鼠體內氧化系統遭到破壞，生成的活性氧自由基不能被及時清除，導致過多的過氧化物在體內蓄積，對大鼠腎臟造成氧化損傷。

綜上所述，本研究揭示了PNMC對大鼠腎臟的損傷作用主要是通過氧化應激引起的，即PNMC通過抑制抗氧化酶的活性引起大鼠腎臟氧化損傷，但這些過程之間的相互作用及調控機制還有待進一步研究。

[1]Tsukue N，Toda N，Tsubone H，et al.Diesel exhaust（DE）affects the regulation of testicular function inmale Fischer 344 rats[J].J Toxicol Environ Health A，2001，63（2）：115-26.

[2]Zayed SM，Mahdy F.Decomposition of 14C-fenitrothion under the in fluence of UV and sunlight under tropical and subtropical conditions[J].Chemosphere，2008，70：1653-1659.

[3]Simon-Giavarotti K A，Giavarotti L，Gomes L F，et al.Enhance?ment of lindane-induced liver oxidative stress and hepatotoxicity by thyroid hormone is reduced by gadolinium chloride[J].JFree Radic Res，2002，36：1033-1039.

[4]Favier A.Le stress oxidant:Intérêt conceptuel et expérimental dans la compréhension desmécanismes desmaladies et potentiel thérapeutique[J].JL’actualitéChim，2003，108-115.

[5]Papas A M.Determinants of antioxidant status in humans[J].J Lipids，1996，31：S77-S82.

[6]Mi Y，Zhang C，Li C M，et al.Quercetin protects embryonic chicken spermatogonial cells from oxidative damage intoxicated with 3-methyl-4-nitrophenol in primary culture[J].Toxicology Letters，2009，190，61-65

[7]Pan C J，Schmitz D A，Cho A K，et al.Inherent redox properties of diesel exhaust particles:catalysis of the generation of reactive oxygen species by biological reductants[J].ToxicolSci，2004，81，225-232.

[8]Yue Z，She R P，Bao H H，etal.Necrosis and Apoptosis of Renal Tubular Epithelial Cells in Rats Exposed to 3-Methyl-4-Nitro?phenol[J].Environmental Toxicology，2012，11（27）：653-661.

[9]LiC，Takahashi S，Taneda S，etal.Impairment of testicular func?tion in adultmale Japanese quail（Coturnix japonica）after a sin?gle administration of 3-methyl-4-nitrophenol in diesel exhaust particles[J].JEndocrinol，2006，189（3）：555-564.

[10]Li C M，Taneda S，Suzuki A K，et al.Effects of 3-methyl-4-ni?trophenol in diesel exhaust particles on the regulation of testicular function in immaturemale rats[J].Journal of Andrology，2007，28（2）：252-258.

[11]Mori Y，Kamta K，Toda N，et al.Isolation of nitrophenols from diesel exhaust particles（DEP）as vasodilatation compounds[J].Bi?ol Pharm Bull，2003，26：394-395.

[12]Taneda S，Kamata K，HayashiH，etal.Investigation of vasodilato?ry substances in diesel exhaust particles（DEP）：Isolation and identification of nitrophenol derivatives[J].JHealth Sci，2004，50：133-141.

[13]NeradilováM，HurbáF，NovákováV，et al.Investigations of the relationship between thyroid function and a-tocopherol concentra?tion of serumand in some organs of the rat[J].Int J Vitam Nutr Res，1973，43：283-290.

[14]Benzie IF.Lipid peroxidation：a review of causes,consequences, measurement and dietary influences[J].Int J Food Sci Nutr，1996，47：233-261.

[15]SubudhiU，Dasa K，Paital B，etal.Alleviation of enhanced oxida?tive stress and oxygen consumption of L-thyroxine induced hyper?thyroid rat liver mitochondria by vitamin E and curcumin[J].J Chem Biol Interact，2008，173：105-114.

[16]BealM F.Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseas?es[J].JBiochim Biophys Acta，1998，1366：211-223.

[17]Beal M F.Mitochondria take centre stage in aging and neurode?generation[J].JAnn Neurol，2005，58：495-505.

[18]Mikhailov V，Mikhailova M，Degenhardt K，et al.Association of Bax and Bak homo-oligomers in mitochondria.Bax requirement for Bak reorganization and cytochrome c release[J].Biol Chem，2003，278：5367-5376.

[19]Donaldson K，Stone V，Borm P J，etal.Oxidative stress and calci?um signaling in the adverse effects of environmental particles[PM（10）][J].Free Radic BiolMed，2003，34：1369-1382.

S865.1+2

B

0529-6005（2015）11-0087-03

2014-06-13

岳卓（1982-），女，博士，研究方向為動物毒理病理學和生物制品學，E-mail：w16154149@163.com

佘銳萍，E-mail：sheruiping@126.com