藤茶活性成分二氫楊梅素對人胚腎細胞和肝細胞增殖的影響

周防震， 鄭小江， 張曉元

（1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000；2.華南理工大學工業研究總院，廣東廣州510641）

藤茶活性成分二氫楊梅素對人胚腎細胞和肝細胞增殖的影響

周防震1， 鄭小江1， 張曉元2

（1.湖北民族學院生物科學與技術學院，湖北恩施445000；2.華南理工大學工業研究總院，廣東廣州510641）

目的 探討藤茶活性成分二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY）對人正常細胞增殖的影響。方法 體外培養人胚腎細胞（HEK-293）和肝細胞（L-02），MTT法觀察DMY對其細胞增殖的影響。結果 DMY對HEK-293和L-02細胞的半數抑制濃度（IC50）分別為475.3μg/mL和324.8μg/mL，而陽性對照藥物順鉑的IC50分別為7.4μg/mL和7.7μg/mL。結論 藤茶活性成分二氫楊梅素對人正常細胞HEK-293和人L-02細胞具有相對低毒性。

藤茶；二氫楊梅素；細胞增殖；人胚腎細胞；人肝細胞

二氫楊梅素（dihydromyricetin，DMY），大量存在于葡萄科蛇葡萄屬植物藤茶（Ampelopsis grossedentata）幼嫩莖葉中。報道表明二氫楊梅素具有抗氧化、抗炎、抗突變、止咳、化痰和抗菌等多種生理活性［1］。近年來二氫楊梅素的抗腫瘤作用日益受到重視，資料顯示二氫楊梅素對人鼻咽癌HK-1細胞［2］、白血病HL-60、K562細胞［3］、肺腺癌AGZY-83-a細胞［4］和人乳腺癌MDA-MB-231細胞［5-6］具有較強的增殖抑制作用，然而有關二氫楊梅素對人正常細胞影響方面的研究尚未見報道。本實驗以人胚腎細胞 （HEK-293）和人肝細胞 （L-02）為研究對象，研究藤茶活性成分二氫楊梅素對其體外增殖的影響，以期為二氫楊梅素的開發和應用開拓新的視野。

1 材料與方法

1.1 材料 二氫楊梅素由華南理工大學工業技術研究總院張曉元教授從藤茶莖葉中提取 （純度為98%，HPLC法測定）；細胞培養基 （DMEM）、胎牛血清 （FBS）為美國Gibco公司產品；細胞培養板購自美國Corning公司；胰蛋白酶和青霉素-鏈霉素雙抗溶液購自上海碧云天生物技術有限公司；注射用順鉑（Cisplatin）購自齊魯制藥有限公司；噻唑藍（MTT）和二甲基亞砜（DMSO）購自美國Sigma公司。HEK-293由湖南中醫藥大學高強博士提供；L-02細胞由暨南大學臨床醫學院段華英碩士提供。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和處理 以每孔4×103的細胞密度將指數增殖期細胞HEK-293和L-02分別接種于96孔板內，培養液為含10%FBS的DMEM，每孔180μL，培養12 h后，每孔加入20μL含不同二氫楊梅素濃度的DMEM完全培養液，二氫楊梅素終質量濃度為20、40、80、160和 320 μg/mL每個濃度設6個復孔。另設空白對照組和陽性藥物順鉑組。細胞置37℃二氧化碳培養箱內培養48 h，待用。

1.2.2 MTT法檢測細胞增殖 取出“1.2.1”項中培養48 h的細胞培養板，每孔加入5 mg/mLMTT 20μL，繼續培養4 h后棄去上清，每孔加入DMSO 200μL，置振蕩儀上充分混勻，采用酶標儀，以570 nm為測試波長，630 nm為參考波長，測量各孔吸光度，計算細胞生長抑制率。抑制率為：（對照組A值-實驗組A值）/對照組A值×100%。

1.2.3 數據分析 半數抑制濃度IC50（50%Inhibitory Concentration）根據IC50計算軟件計算；試驗所得數據均用平均數±標準差 （）表示，統計學處理應用SPSS 13.0統計軟件包中的One-way ANOVA（單因素方差分析）進行統計分析，P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 二氫楊梅素和順鉑對HEK-293細胞增殖的影響 作用48 h，100～180μg/mL的二氫楊梅素對HEK-293增殖具有顯著的抑制作用；低于60μg/mL的二氫楊梅素對人HEK-293增殖的影響，與對照組相比不具統計學意義 （圖1）；而5～40μg/mL順鉑對HEK-293均有顯著的抑制作用（圖2）。

2.2 二氫楊梅素和順鉑對L-02細胞增殖的影響 作用48 h，40～160μg/mL二氫楊梅素對L-02細胞增殖具有顯著的抑制作用；低于40μg/mL的二氫楊梅素對L-02細胞增殖的影響，與對照組相比不具統計學意義 （圖3）；而0.625～20μg/mL順鉑對L-02細胞均有顯著的抑制作用（圖4）。

2.3 二氫楊梅素和順鉑對HEK-293和L-02細胞的IC50二氫楊梅素對HEK-293和L-02細胞的IC50分別為475.3和324.8μg/mL；而順鉑對HEK-293和L-02細胞的IC50分別為7.4和7.7μg/mL（表1）。

圖1 二氫楊梅素對HEK-293增殖的影響

圖2 順鉑對HEK-293增殖的影響

圖3 二氫楊梅素對L-02細胞增殖的影響

圖4 順鉑對L-02細胞增殖的影響

3 討論

肝和腎是人體重要的器官，對維持正常生理平衡具有十分重要的作用。許多化療藥物缺乏對正常細胞和腫瘤細胞的選擇性，不僅可能破壞免疫系統，導致機體對腫瘤的自我保護屏障喪失，而且能損害人體肝、腎等重要器官，進而影響其功能，對人體毒副作用大，嚴重地影響了藥物的臨床效果［7］。

表1 二氫楊梅素和順鉑對HEK-293和L-02細胞的IC50

前期研究發現，順鉑對人乳腺癌MDA-MB-231細胞的IC50為2.53μg/mL（數據待發表），本試驗中化療藥物順鉑對人胚腎細胞HEK-293和人肝細胞L-02的IC50分別為7.4μg/mL和7.7μg/mL，表明化療藥物順鉑細胞選擇性較差，具有明顯的肝、腎毒性，這與文獻報道一致［8-9］。蘇東林等［10］利用大鼠從活體水平證明了二氫楊梅素的低毒性，Wistar大鼠口服灌胃的最大耐受量為5.0 g/kg，同時還發現二氫楊梅素能有效預防和治療酒精性肝損傷。張友勝等［11］利用小鼠從活體水平證明了二氫楊梅素的低毒性，小鼠灌胃最大耐受量5.0 g/kg，腹腔注射半數致死量為（1.41±0.13）g/kg。本研究離體條件下藤茶活性成分二氫楊梅素對人正常腎細胞和肝細胞增殖的影響，結果顯示二氫楊梅素對HEK-293和L-02細胞的IC50分別為475.3 μg/mL和324.8μg/mL，表明離體條件下二氫楊梅素對人正常細胞HEK-293和人L-02細胞具有相對低毒性。以前的研究［5］發現二氫楊梅素對人乳腺癌細胞MDA-MB-231的IC50為73.6μg/m L，遠遠小于二氫楊梅素對人胚腎細胞HEK-293和人肝細胞L-02的IC50，表明二氫楊梅素不僅具有低毒性，其抗腫瘤作用還具有明顯的細胞選擇性。

藤茶是一種古老的藥食兩用植物，長期作為類茶植物和中草藥在民間廣泛使用，其干燥莖葉中二氫楊梅素的含量可達30%以上［12］。近年來，藤茶已逐漸被人們所接受并成為受人們青睞的保健品。本研究從離體條件證明了二氫楊梅素對人正常肝、腎細胞的低毒性，豐富了藤茶安全性的新認識，有助于進一步增強市場和消費者對藤茶的信心，進而加快藤茶的開發和利用步伐。

［1］ 周防震，張曉元，郭 勇.二氫楊梅素抗腫瘤及其機制的研究進展［J］.中華中醫藥學刊，2010，28（9）：1914-1916.

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細胞MDA-MB-231的體外抗增殖作用［J］.腫瘤防治研究，2012，39（1）：95-97.

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R285.5

B

1001-1528（2015）12-2756-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.12.040

2014-08-23

湖北民族學院博士啟動基金項目 （MY2012B010）

周防震 （1976—），男，博士，副教授，主要研究方向為酶工程與生物制藥，Tel：（0718）8438261，E-mail：tentzf.student @sina.com