缺血/再灌注時心肌保護通路的研究進展

屈園園(綜述)，余鋰鐳，江　洪(審校)

(武漢大學人民醫院心內科，武漢 430060)

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缺血/再灌注時心肌保護通路的研究進展

屈園園△(綜述)，余鋰鐳，江洪※(審校)

(武漢大學人民醫院心內科，武漢 430060)

摘要：近年來，我國急性心肌梗死發病率明顯上升，已接近國際平均水平。心肌缺血/再灌注損傷(I/RI)是缺血心肌恢復血運后的常見并發癥。研究表明，I/RI與線粒體功能結構損害關系密切。心肌發生缺血/再灌注時，心肌細胞發生一系列病理生理變化。迄今為止,已發現多種手段可用來減弱I/RI，該保護通路包括乙酰膽堿、一氧化氮合酶、一氧化氮、內皮細胞、蛋白激酶Cε、線粒體連接蛋白43、線粒體ATP敏感性鉀離子通道。

關鍵詞：缺血/再灌注損傷；心肌細胞；線粒體

發生心肌梗死時，及時手術或溶栓治療能挽救部分心肌，降低心功能損傷程度。但在血流恢復的同時，伴隨有缺血/再灌注損傷(ischemia/reperfusion injury，I/RI)。缺血預處理(ischemic precondition，IPC)、缺血后處理、藥物處理以及迷走神經刺激術均能發揮心肌保護作用，對抗I/RI。傳統觀念認為[1]，線粒體是真核細胞ATP生成的主要場所。新近研究發現[2]，缺血/再灌注時線粒體與心肌保護通路關系密切，是心肌細胞存活和心律失常發生的一個關鍵因素。對于該保護通路的研究越來愈多，但其保護機制尚未完全明了，現就該通路及其構成進行綜述。

1乙酰膽堿

早期研究發現[3]，乙酰膽堿(acetylcholine,Ach)是依賴于內皮細胞的血管擴張因子。缺血/再灌注發生后，心臟冠狀動脈對Ach的擴張反應顯著降低。而只對實驗動物進行缺血處理，取下冠狀動脈后發現，其對Ach的舒張反應并無變化[4]，證明心肌缺血后內皮功能受損是再灌注損傷的表現。

Ach通過一氧化氮(nitric oxide，NO)，選擇性增加蛋白激酶Cε(protein kinase Cε，PKCε)酶活性，而對其他PKC異構體無任何影響[5]。缺血和再給氧可產生大量自由基，短暫給予Ach可顯著減輕氧化應激反應，增加存活的心肌細胞。毒蕈堿受體對于氧自由基的產生至關重要，生成的這些氧自由基中，NO占到大部分，但同時也存在其他含氧產物，如H2O2[5]。

2一氧化氮合酶

NO可由3種一氧化氮合酶( nitric oxide synthase,NOS)異構體催化合成——誘導型NOS(inducible NOS，iNOS)、內皮型NOS(endothelial NOS，eNOS)，神經型NOS(neuronal NOS，nNOS)。心肌細胞持續表達eNOS和nNOS，并通過亞細胞定位依賴性途徑誘導出其生物學活性[6]。正常情況下，心肌細胞不表達iNOS，在某些應激條件下可表達，因此被認為對心臟有害。NOS催化L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸和NO，該過程需要還原型輔酶Ⅱ、黃素單核苷酸、黃素腺嘌呤二核苷酸、鈣調蛋白、血紅素和四氫生物嘌呤作為輔助因子參與。在缺血/再灌注發生時，NOS脫偶聯，失去轉換功能，無法將L-精氨酸轉化為L-瓜氨酸，NOS將電子自還原型輔酶Ⅱ轉移至1分子氧上，生成超氧化物(O2-)，而非NO。由于NOS脫偶聯，超氧化物生成，導致心肌組織處于氧化應激狀態，心功能因此受損。伴隨氧化應激狀態，由NOS生成而來的NO水平下降，生物利用度下降。研究表明[7]，糖尿病患者在缺血/再灌注時，iNOS是酶脫偶聯的靶點，補充BH4，iNOS發生再偶聯，保護心臟[8]。盡管尚未完全了解NOS脫偶聯的原因，但BH4被超氧化物氧化，NOS磷酸化，NOS功能性二聚體遭到破壞在其中發揮重要作用。缺血/再灌注發生可引起NOS脫偶聯，而NOS脫偶聯可進一步促進再灌注后的損傷和心功能不全的發生，導致I/RI[9]。

NOS脫偶聯最顯著的誘因是：NOS的輔助因子BH4被氧化，或者二氫葉酸還原酶表達減少，最終導致BH4生成減少。三磷酸鳥苷通過多個步驟生成BH4，BH4還可以通過另一補救途徑生成——回收的二氫葉酸還原酶將循環的氧化7，8-二氫生物蝶呤轉化為BH4。氧化應激清除BH4，在NOS脫偶聯中發揮主要作用。超氧化物可直接將BH4氧化為二氫生物蝶呤，NOS二聚體解體發生脫偶聯。缺血/再灌注時，這是NOS脫偶聯的主要原因，由于超氧化物增多，BH4/二氫生物蝶呤比例下降，NOS發生解偶聯。氧化應激通過氧化作用，直接降低二氫葉酸還原酶表達，以此降低補救旁路的活性，影響BH4生物利用度[10]。

3NO

NO不僅是內皮細胞產生的松弛因子，還能影響心臟器質和功能。通過刺激可溶性鳥苷酸環化酶，引起環鳥苷酸水平增高，并激活蛋白激酶[11]。同時存在一條不依賴于cAMP的NO作用途徑，NO將胱氨酸殘基的游離巰基硝基化(S-亞硝基化)，這能改變酶活性，對心功能的改變至關重要[12]。NOS脫偶聯導致了兩種損傷：NO產量下降，過氧化物生成增多。NO除了具有抗氧化作用，還能抑制由還原型輔酶Ⅱ氧化酶催化的超氧化物產生，這種超氧化物是病理狀態下O2-的主要來源[13]。NO可以成為細胞內氧化應激的調節器。NO可與超氧化物O2-反應生成過氧硝酸鹽(ONOO-)。過氧硝酸鹽本身對細胞有害，但與O2-相比危害較小，同時還能促進氧化應激。

NO還對心臟收縮功能產生影響，將該作用稱為不依賴于可溶性鳥苷酸環化酶的S-亞硝基化激活。NO通過非酶促附著的S-亞硝基化來降低-SH的數量，產生翻譯后化學修飾，引起相應的生物學功能[S-亞硝基化最重要的靶點(心臟)是電子鏈，尤其是心肌肌漿網Ca2+釋放通道——蘭尼堿2型受體][14]。心肌細胞中的nNOS位于肌質網上，敲除小鼠nNOS基因導致心臟射血分數下降，Ca2+分布瞬間改變[15]。蘭尼堿2型受體無法被S-亞硝基化，隨即Ca2+從細胞肌質網漏出(Ca2+漏出不會降低收縮能力，但容易誘發心律失常)。心肌細胞內eNOS可調控鈣通道功能，eNOS位于L-型鈣調蛋白通道上利于S-亞硝基化，能抑制Ca2+灌流[12]。脫偶聯時，NO生成減少，O2-生成增加導致氧化應激，使心肌受損，心臟收縮功能降低。

4內皮細胞受損

缺血后階段內皮功能障礙需要氧分子的參與，內皮細胞的I/RI源于活性氧類(reactive oxygen species，ROS)的生成。ROS清道夫可以減弱或阻止內皮細胞功能障礙的發生。動物實驗表明[16]，再灌注所致的內皮細胞損傷是由氧自由基衍生物所致，在微循環內，給予超氧物歧化酶和過氧化氫酶，依賴于內皮細胞的舒張功能受損的情況可得到改善。

氧自由基引起內皮細胞損傷可由一些機制解釋。超氧化陰離子(O2-)一旦生成，會鈍化NO。而NO可抑制中性粒細胞的激活和黏附，所以NO產量降低可導致急性炎癥反應的發生、發展。另外，再灌注時期生成的自由基也會通過誘導黏附分子(如選擇蛋白或細胞間黏附分子1)激活中性粒細胞，使其迅速黏附于內皮細胞。NO產量降低，自由基生成增加，兩者聯合使中性粒細胞對內皮細胞的黏附作用增強，中性粒細胞對內皮細胞的損傷作用得到放大?？紤]到NO還有擴張血管的重要屬性，內皮細胞受損同時導致冠狀動脈收縮增強，冠狀動脈痙攣發生的風險增加。

5PKCε

近幾年的研究較多關注PKCε在IPC中的作用，試圖理解其機制。有證據顯示，PKCε在IPC時轉移至線粒體[17]，PKCε的肽催化劑(將PKCε傳遞至線粒體)使心肌具備抵抗I/RI的能力，表明心肌保護作用源于線粒體內PKCε的調控作用。IPC在線粒體中的信號轉導體系中，數個轉導信號均為PKCε的靶點，其中包括線粒體通透性轉換孔。盡管ROS形成過多會對心肌細胞造成損害，但少量的ROS能誘發IPC的保護作用，激活PKCε。NO選擇性激活PKCε異構體，PKCε激活后在細胞內轉移，其效應與IPC相同。

6線粒體連接蛋白43

線粒體連接蛋白43(mitochondrial connexin 43，mCx43)存在于線粒體內膜上。已有實驗證明[18]，IPC能增加線粒體上mtCx43的含量。體外實驗中觀察到，PKCε能將mCx43磷酸化，在心肌細胞保護作用的信號級聯反應中，PKCε位于mCx43上游[19]。細胞保護性信號轉導過程中，PKC及其下游的線粒體ATP敏感性鉀通道(mitochondrial ATP-sensitive K+channel,mKATP)均位于肌膜下的線粒體，與上游的受體相鄰。肌原纖維間的線粒體與這些細胞保護通路無關，這類線粒體上的mKATP對二氮平(mKATP開放劑)和PKC均不敏感[18]，說明不同的線粒體亞群有不同的亞細胞功能，只有肌膜下線粒體通過激活mKATP來達到保護心肌細胞的目的。

7mKATP

有研究顯示，氧自由基衍生物產物通過激活mKATP通道和線粒體通透性轉換孔，促發IPC信號轉導通路。mKATP通道開放后，K+流入線粒體，使線粒體基質產生去極化以及堿化作用，IPC早期和晚期，基質的這些變化通過誘導ROS的下游產物，反過來激活細胞存活通路[19]。mKATP可在再灌注發生后降低ROS的產量，維持線粒體膜電位在較高水平，保護線粒體呼吸功能。在缺血缺氧情況下，呼吸鏈迅速減少。大量ROS生成，使呼吸鏈中的電子迅速漏出，氧化磷酸化脫偶聯，因此ATP生成減少，呼吸鏈的膜磷脂和蛋白也受到損傷。在缺血缺氧條件下，ATP/ADP比率下降可激活mKATP。吡那地爾心停搏法降低了線粒體ROS的產量，而5-羥基葵酸鹽(mKATP選擇性阻滯劑)可部分阻斷該作用，表明mKAPT通道開放可降低線粒體的氧化性損傷，維持能量供給[20]。mKATP開放對心肌具有保護作用，其機制可能為：減少ATP喪失，削弱氧化損傷，維持線粒體膜電位，抑制細胞內鈣超載。

8結語

發生心肌梗死的患者越來愈多，隨著介入手術和冠狀動脈旁路移植術的普及，I/RI越來越受到人們的重視，對于心肌保護通路的研究多年來一直是學術界的熱點。近年來國內外多項實驗多傾向于從線粒體水平上研究亞細胞結構的改變和心肌細胞受損情況，并發現存在于細胞膜上轉導動作電位的Cx43同時也存在于線粒體膜上。通過各種干預，在一系列細胞信號作用下，線粒體通透性轉換孔和mKATP開合情況發生變化，最終導致線粒體受到不同程度的損傷。這些新的研究成果，為深入了解I/RI的發生機制及治療手段提供理論依據。

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A Study of Myocardial Protective Pathway in Ischemia-ReperfusionQUYuan-yuan,YULi-lei,JIANGHong.(DepartmentofCardiology,RenminHospitalofWuhanUniversity,Wuhan430060,China)

Abstract：The incidence of acute myocardial infarction has been ascending notably in recent years and is reaching international average.Myocardial ischemia/reperfusion injury(I/RI) is a common complication after recover of the blood supply in ischemic myocardium.Studies show that I/RI is closely associated with impairment of mitochondrial function and structure.Cardiomyocytes suffer from a series of pathophysiological changes when ischemia/reperfusion occurs in myocardial infarction.So far multiple measures have been discovered to attenuate I/RI.This protective pathway includes acetylcholine,nitrogen monoxide synthase,nitrogen monoxide,protein kinase Cε,mitochondrial connexin 43 and mitochondrial ATP sensitive potassium channel.

Key words：Ischemia/reperfusion injury; Myochardium; Mitochondria

收稿日期：2014-10-20修回日期：2015-02-27編輯：伊姍

doi：10.3969/j.issn.1006-2084.2015.18.007

中圖分類號：R543.31

文獻標識碼：A

文章編號：1006-2084(2015)18-3283-03