高效液相色譜法測定還原型谷胱甘肽鈉的含量

宗春燕，朱 娜，蘇學軍

（泰州職業技術學院，江蘇 泰州 225300）

還原型谷胱甘肽鈉商品名為松泰斯，化學名稱為N-（N-L-谷氨?；?L-半胱氨?；└拾彼徕c鹽，白色結晶性粉末，具有輕微的特征氣味。谷胱甘肽制劑可用于酒精中毒或某些藥物中毒的治療，亦具有抗過敏、抗氧化、增強免疫力、延緩衰老、抗癌、抗輻射及輔助化療等功效，因而在醫藥工業中得到了廣泛的應用[1，2]。另外，還原型谷胱甘肽鈉在食品中的應用也令人矚目[3]，如添加到乳制品中有相當于維生素C的功效，可防止水果褐變，還可用作食品風味劑，是重要的食品功能因子。

谷胱甘肽鈉的生產方法主要有化學合成法、酶轉化法、發酵法和溶劑提取法[3]。目前，化學合成法和提取法已經工業化，酶轉化法正在進行廣泛研究。由于國內谷胱甘肽鈉的研究起步較晚，對還原型谷胱甘肽鈉的分離分析一直是研究的熱點[4，5]。文獻報道采用的紫外分光光度法測定谷胱甘肽鈉的含量，準確度不高，且干擾嚴重[6]。毛細管區帶電泳分析法雖可實現快速檢測，精密度及準確度較高，但對操作要求較高[7]。本文采用高效液相色譜儀附紫外檢測器，以磷酸二氫鈉鹽溶液為流動相，在210nm波長下測定還原型谷胱甘肽鈉的含量，能準確檢測出樣品中的主要成分，適用于注射用還原型谷胱甘肽鈉制劑含量的測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters2695高效液相色譜儀，配有紫外檢測器及數據處理軟件，Waters公司；Sartorius電子天平，北京賽多利斯儀器有限公司；PS-30A超聲波清洗器，東莞潔康超聲波設備有限公司。二水合磷酸二氫鈉（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；乙腈、磷酸（色譜純，購自MERCK公司）、谷胱甘肽對照品（純度≥99.0%，自制）；二次蒸餾水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Synergi4u Hydro-RP 80A 250×4.60mm；流動相：稱取二水合磷酸二氫鈉3.90g，溶解到500mL二次蒸餾水中，用85%磷酸調節pH值至2.8，加二次蒸餾水稀釋到1000mL，過濾，經超聲波清洗器脫氣冷卻后即得。檢測波長選擇210nm，柱溫為30℃，流速為1.5 mL/min；進樣體積 20μL。

1.3 測定方法

1.3.1 對照品溶液的制備

準確稱取谷胱甘肽鈉50.0mg，置于100mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度并搖勻備用。因還原型谷胱甘肽鈉不穩定，受溫度和光線影響后極易氧化成氧化型谷胱甘肽鈉，因而本品應臨用現配。

1.3.2 樣品溶液的制備

準確稱取還原型谷胱甘肽鈉樣品50.0mg，加流動相配制成每1mL含還原型谷胱甘肽鈉0.5mg的溶液，搖勻后備用。

1.3.3 樣品的測定

分別取已制備好的樣品溶液和標準對照品溶液20μL，在相同色譜條件下待基線穩定后，連續數針進樣，調節好檢測靈敏度，以保留時間定性，峰面積定量。根據樣品峰的峰面積，按下式公式計算出樣品中谷胱甘肽鈉的含量。

樣品中還原型谷胱甘肽鈉的含量：

式中：A—對照品溶液中還原型谷胱甘肽鈉的峰面積；A＇—樣品溶液中還原型谷胱甘肽鈉的峰面積；m1—還原型谷胱甘肽鈉對照品的質量，mg；m2—還原型谷胱甘肽鈉樣品的質量，mg；χs—對照品中還原型谷胱甘肽鈉的質量分數。

2 結果與討論

2.1 色譜條件的選擇及系統適用性色譜柱

2.1.1 色譜條件的選擇

將配制好的對照品溶液，利用可變波長檢測器進行全波長掃描，結果發現,還原型谷胱甘肽鈉在210m處有最大吸收值，故選擇210nm作為檢測波長，與文獻一致[5]。

2.1.2 流動相的選擇

通過選用磷酸二氫鈉和乙腈的混合溶液及磷酸二氫鈉鹽溶液進行了多次比對試驗，結果表明,采用磷酸二氫鈉鹽溶液的檢測靈敏度可滿足檢測要求，且乙腈混合液有毒，成本高。對鹽溶液的濃度配比進行了考查，發現濃度為0.0325mol/L時保留時間適當且峰形對稱完整，故最終選定以磷酸二氫鈉和水的鹽溶液作為流動相。

2.1.3 流速的選擇

實驗發現，流速對還原型谷胱甘肽鈉的分離有一定影響，當流速增大時，色譜峰變窄，分離度變??；當流速減小時，色譜峰變寬，分離度變大?？紤]到峰寬和分離度的要求，合適的流速選為1.5mL/min。

2.1.4 流動相pH值的選擇

考查不同pH值的流動相對實驗的影響，結果顯示，pH值的變化會引起谷胱甘肽鈉峰面積的變化，pH值在2.8～3.0之間，谷胱甘肽鈉的吸收程度高，靈敏度也比較高，最終選擇流動相的pH值為2.8。

2.1.5 系統適用性

系統適用性色譜柱的理論塔板數不低于3000，對照品色譜圖中色譜峰的分離度符合要求。

2.1.6 線性關系的確定

將配制的對照樣按5個不同濃度梯度進樣，進行液相色譜分析。以谷胱甘肽鈉質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程為y=40.25x+53.84，相關系數為R=0.9998。

2.2 專屬性試驗

取上述選定的色譜條件，將配制好的谷胱甘肽鈉對照品溶液、還原型谷胱甘肽鈉試樣溶液以及用流動相作為稀釋液的空白溶液，進樣，記錄圖譜。

實驗之前需進一針空白，保證流動相無污染，無其它雜質，以防止影響樣品含量的計算，對照品圖譜如圖1所示，樣品圖譜如圖2所示。

2.3 精密度試驗

取還原型谷胱甘肽鈉對照品溶液一份，連續進樣5次，記錄峰面積，結果如表1所示，RSD=0.03%。同樣條件下，再測定兩份樣品，RSD均小于1.00%。

表1 精密度試驗結果

2.4 含量測定

平行取供試品2批，一式兩份，加入流動相配制成每1mL含還原型谷胱甘肽鈉0.5mg的溶液，取適量注入色譜儀，記錄色譜圖，結果見表2。由表2可見，該法的準確度良好。

表2 供試品含量測定結果

還原型谷胱甘肽鈉含量的企業指標含量大于或等于90.0%，因此測定兩批供試品的還原型谷胱甘肽鈉的含量符合要求，為合格品。

3 結論

目前國內關于還原型谷胱甘肽鈉含量的高效液相色譜法分析報道相對較少，本文通過實驗探索的分析方法，其精密度和準確度較高，峰分離度表現良好，可用于還原型谷胱甘肽鈉制劑含量的測定，為企業產品質量控制提供了檢測依據。

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[3]江潔，單立峰.谷胱甘肽的生產及其在食品工業中的應用[J].中國調味品，2009，34（2）:40-44.

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[5]王愛月，解魁，李發生.高效液相色譜法測定保健食品中谷胱甘肽含量的方法研究 [J].中國衛生檢驗雜志，2007，17（7）：1181-1182.

[6]翟文慧，王愛月.紫外分光光度法測定保健食品中谷胱甘肽[J].預防醫學論壇，2005，11（5）：560-561.

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