電針對魚藤酮誘導的帕金森病模型大鼠黑質內ERK1/2及TNF-α的影響

王述菊　馬　駿　王彥春　曾曉玲　龔元勛　梁　艷　孫國杰(湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，湖北　武漢　430065)

?

電針對魚藤酮誘導的帕金森病模型大鼠黑質內ERK1/2及TNF-α的影響

王述菊馬駿王彥春曾曉玲龔元勛梁艷孫國杰
(湖北中醫藥大學針灸骨傷學院，湖北武漢430065)

〔摘要〕目的探討電針對帕金森病(PD)模型大鼠黑質內ERK1/2信號通路及炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α的作用及機制。方法雄性健康SD大鼠32只，隨機分為正常組、假手術組、模型組、電針組，每組8只。模型組和電針組經頸背部注射魚藤酮造模14 d，造模后進行行為學評價，電針組給予電針“風府”和“太沖”兩穴治療，連續治療14 d;其余各組不做治療，假手術組給予相同劑量的DMSO和生理鹽水混合液。采用免疫組化法檢測大鼠黑質區磷酸化的ERK1/2、酪氨酸羥化酶(TH)、TNF-α陽性細胞表達情況。結果各組大鼠神經行為學表現存在差異，與正常組、假手術組相比，模型組大鼠黑質區TH陽性細胞數減少(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α陽性細胞數增加(P＜0. 05);與模型組相比，電針組大鼠黑質區TH陽性細胞數增加(P＜0. 05)，磷酸化的ERK1/2、TNF-α陽性細胞數減少(P＜0. 05)。結論電針可以通過調節PD模型大鼠體內MAPK/ERK1/2通路，降低p-ERK1/2在PD模型大鼠黑質區的表達，進而減少TNF-α的表達，對PD病的發生發展起到一定的調節作用。

〔關鍵詞〕帕金森病;電針; MAPK/ERK1/2; TNF-α;酪氨酸羥化酶

1　材料與方法

1. 1實驗動物及分組健康雄性SD大白鼠32只，體重(180± 20)g，由華中科技大學同濟醫學院實驗動物學部提供〔(合格證: SCXK(鄂)2010-0009，No. 4209800307〕。所有動物均在通風良好條件下分籠飼養，自由攝食、飲水。將動物隨機分成正常組、假手術組、模型組及電針組，各8只。實驗對動物的處理方法符合2006年中華人民共和國科學技術部頒發的《關于善待實驗動物的指導性意見》。

1. 2主要藥物試劑及器材魚藤酮(rotenone)(美國Sigma公司)，二甲基亞砜(DMSO)(國藥集團化學試劑有限公司)、p-ERK、TNF-α抗體(北京博奧森公司)，兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，4%多聚甲醛(國藥集團化學試劑有限公司)，10%水合氯醛(按國產分析純水合氯醛1 g，無菌生理鹽水9 ml比例配制)，S-P超敏試劑盒(鼠/兔)(福州邁新生物技術開發有限公司)，山羊抗兔免疫組化試劑盒(北京中杉金橋公司)，所有試劑均以焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的雙蒸水配制。0. 30 mm×13 mm不銹鋼毫針(蘇州產華佗牌)，G6805-2型電針治療儀(上海醫療器械廠)。

1. 3造模方法大鼠適應環境1 w后隨機分組，開始造模，采取頸背部皮下注射魚藤酮法制備PD大鼠模型。用DMSO和生理鹽水溶解魚藤酮配制成0. 25 mg/ml溶液(魚藤酮∶DMSO∶生理鹽水= 1 g∶3. 5 L∶0. 5 L)。其中模型組和電針組按1 mg· kg－1·d－1注射魚藤酮〔3〕，假手術組經相同方式給予相同體積的DMSO和生理鹽水混合液(DMSO∶生理鹽水= 3. 5 L∶0. 5 L)，1次/d，連續14 d，正常組不予注射。

參照Chen等〔4〕行為學評分標準，PD模型大鼠出現典型的毛色變黃變臟、弓背、拘捕減弱、震顫等表現視為造模成功。

1. 4針刺方法電針組:對造模成功后的大鼠給予電針治療，給大鼠穿上自制的鼠衣固定，取“風府”、“太沖”穴，用0. 30 mm×13 mm不銹鋼毫針針刺，進針約4 mm，接G6805-2型電針治療儀，正極接“風府”穴，負極接“太沖”穴(雙側“太沖”穴每天交替)，采用連續波，頻率為2 Hz，刺激強度以大鼠腿部輕微抽動為度(2～6 mA)，治療20 min，1次/d，7 d為1個療程，療程間休息1 d，共治療2個療程后根據預定時間分別取材。其他組每天在相同時間抓取固定，但不給予治療。四組動物同步喂養、取材。

1. 5樣本采集四組處理結束24 h后，大鼠用10%水合氯醛(0. 4 g/kg)麻醉，仰臥位固定，開胸，暴露心臟，用灌胃針經左心室穿刺入升主動脈，剪開右心耳，先用0. 1 mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)左心室灌流沖洗，后用含4%多聚甲醛磷酸緩沖液常規灌洗固定，待大鼠全身僵硬后，迅速斷頭取腦，留取中腦部分置于4%多聚甲醛中固定48 h(4℃)。石蠟包埋切片。

1. 6 S-P免疫組化法檢測腦組織行冠狀面連續切片(厚度約4 μm)，常規脫蠟至水，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);檸檬酸抗原修復液煮沸對組織進行抗原修復;滴加50 μl過氧化酶阻斷溶劑后孵育10 min以阻斷內源性過氧化物酶活性，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);同一組織相鄰切片分別加入一抗即兔抗鼠TH單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)(1∶200)、羊抗鼠p-ERK、TNF-α單克隆抗體(北京博奧森公司)(1∶100); 4℃過夜; PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);加入50 μl二抗室溫下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);滴加50 μl鏈霉菌抗生物素-過氧化物酶溶液，室溫下孵育10 min，PBS(pH7. 4)洗3次(3 min/次);二氨基聯苯胺(DAB)顯色;蘇木素復染，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂封固;鏡下觀察。陰性對照一抗用PBS代替，其余步驟同以上操作。選定黑質所在區域，使用IMS圖像分析系統軟件分析。每組觀察5張切片，每張切片在光鏡高倍鏡下隨機取4個4 mm2視野，計算陽性反應細胞數，各組每張切片的4個視野陽性細胞計數相加后取平均值。

返鄉創業農民工是壯大非遺文化產業的重要主體。由于返鄉創業農民工了解外面的市場需求，當家鄉的鄉村旅游、文化休閑、觀光農業等產業發展起來時，具有歷史記憶、地域特點、民族風情的特色文化產品逐漸被人接受與熟識，因此返鄉創業農民工能夠參與市場競爭，做大做強非物質文化遺產的產業項目，推動非物質文化遺產的產業化發展。同時農民工返鄉創業集群多渠道引進資金、人力來實現中小非遺文化企業的培育，有利于壯大非遺文化產業發展隊伍，提升非遺文化產業的整體實力。

1. 7統計學方法應用SPSS16. 0軟件進行單因素方差分析(ONE-WAY ANOVA)，繼而以SNK-q檢驗處理數據。P＜0. 05為差異有統計學意義。

2　結果

2. 1大鼠行為學改變觀察魚藤酮注射5 d后即有大鼠表現出捕捉時反抗減弱的現象，逐漸出現主動活動減少、爬行活動緩慢、震顫、拱背狀姿勢、瞬目減少、對刺激逃避反應慢等類似PD癥候群特征;另外，魚藤酮注射大鼠由于自我清潔能力下降，其毛色逐漸發黃，變臟，有掉毛現象，與其余組有明顯區別。部分大鼠有輕微口腔出血等現象，另外有大鼠出現肌肉震顫、全身抖動、四肢發僵等類PD癥狀，隨著造模天數增加，上述表現更加明顯。假手術組和正常組大鼠皮毛光滑，活潑好動，飲食如常。經電針治療后，電針組PD大鼠的異常行為明顯改善。

2. 2大鼠中腦黑質區TH、p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞數變化

模型組TH陽性細胞明顯少于其余三組，p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞明顯多于其余三組，與模型組相比，電針組大鼠黑質區TH陽性細胞明顯增多，p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞明顯減少(P＜0. 05)。見表1。

2. 3大鼠中腦黑質區TH、p-ERK1/2、TNF-α形態學變化TH陽性細胞質呈棕黃色，模型組TH陽性細胞較正常組明顯減少，突起較少，染色明顯減弱，電針組與模型組差異明顯。p-ERK1/2和TNF-α的表達主要在細胞質，正常組大鼠黑質陽性細胞數量較少，胞質著色較淺，而模型組大鼠黑質陽性細胞數量增多，并且胞質染色明顯加深，電針組與模型組差異明顯。見圖1～圖3。

表1　各組大鼠中腦黑質區TH、p-ERK1/2、TNF-α陽性細胞數(個/mm2，n=8，x±s)

圖1　各組大鼠中腦黑質區組織TH表達(×400)

圖2　各組大鼠中腦黑質區組織p-ERK1/2表達(×400)

圖3　各組大鼠中腦黑質區組織TNF-α表達(×200)

3　討論

現今PD的發病機制尚不明確，多數觀點認為該病系由遺傳和環境因素共同作用所致。在遺傳方面，Parkin、PARK5基因的過表達與抑制、細胞內信號轉導通路網絡的異常激活都可引起DA神經元活性發生改變。而環境因素引起的氧化應激、炎癥反應及線粒體功能障礙亦是引起DA神經元死亡的主要原因〔5〕。在眾多PD的危險因素中，越來越多證據表明，以小膠質細胞激活為主的腦內炎癥與PD的病程發展相關〔6〕。Reale等〔7〕發現PD患者MCP-1、TNF-α、IFN-γ、IL-lβ等因子的表達水平顯著增高(P＜0. 01)。本課題組在前期的研究中亦發現〔8〕，電針能夠通過抑制黑質區小膠質細胞介導激活的炎癥反應，減少炎癥介質如TNF-α，IL-1β，IFN-γ的表達，從而增加黑質TH陽性神經元數量，促進DA能神經元恢復，阻止PD病理進程，對PD的癥狀起到一定的改善作用。

有文獻證實〔9〕，ERK1/2大量存在于中樞神經系統，并參與神經組織的各個生理和病理過程。在剖檢的PD患者中腦黑質中有明顯的p-ERK顆粒聚集，而在正常對照老年組卻極少有磷酸化ERK1/2聚集〔10〕。近來有研究發現ERK1/2的活化與PD密切相關，靜息狀態時ERK1/2位于細胞的胞質內，當被激活后，ERK1/2迅速進行磷酸化反應，以便同時調節其他一些轉錄因子的活性，如Elk-1、NF-κB、IL-1、c-Jun、c-fos、ATF、AP-1、TNF-α等，使其基因轉錄改變，進而調節各自蛋白基因表達發生，最終可以引起細胞的物質能量代謝過程和生理生化功能水平的變化，導致特定生物學效應的產生〔11〕。周丹等〔12〕發現在全身炎癥過程中，ERK信號通路參與脊髓中細胞信號的轉導過程，且主要表達于小膠質細胞，表明ERK這條信號通路參與小膠質細胞的炎癥應答過程。趙明等〔13〕的研究發現，ERK1/2通路能被TNF-α強烈激活，通過對轉錄因子的作用而影響TNF-α的產生和生物學效應。姜勇等〔14〕的研究發現，ERK、p38和JNK三條通路的激活可能參與了脂多糖(LPS)刺激引起的TNF-α啟動子轉錄活性增加機制，它們的協同效應共同發揮了對TNF-α基因表達的調控。本實驗結果顯示，電針可以降低魚藤酮誘導的PD模型大鼠中腦黑質內ERK1/2信號通路的表達水平，同時降低炎性因子TNF-α的表達。

綜上所述，電針對PD病模型大鼠癥狀的改善可能與其抑制炎性反應早期大鼠黑質區ERK1/2的磷酸化密切相關，并可能通過抑制ERK1/2的活化達到減少TNF-α的結果。

4參考文獻

1 McGeer PL，McGeer EG. Inflammation and neurodegeneration in Parkinson＇s disease〔J〕．Parkinsonism Relat Disord，2004; 10(1): S3-7.

2 Nichols A，Camps M，Gillieron C，et al．Substrate recognition domains with in extracellular signal regulated kinase mediate binding and catalytic activation of mitogen-activated protein kinase phosphatase-3〔J〕．J Biol Chem，2000; 275(32): 24613-21.

3李云鵬，董兆君，王仕麗，等.重復注射魚藤酮對中樞多巴胺神經元的毒性作用〔J〕．第三軍醫大學學報，2003; 25(13): 1123-6.

4 Chen Y，Constantini S，Trembovler V，et al．An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology，histopathology，and cognitive deficits〔J〕．J Neurotrauma，1996; 13(10): 557-68.

5王述菊，方劍喬，馬駿，等.電針對魚藤酮誘導的帕金森病模型大鼠黑質酪氨酸羥化酶、環氧合酶-2表達的影響〔J〕．針刺研究，2013; 38(3): 198-201.

6 Liu B，Hong JS. Role of microglia in inflammation-mediated neurodegenerative diseases: mechanisms and strategies for therapeutic intervention 〔J〕．J Pharmacol Exp Ther，2003; 304(1): 1-7.

7 Reale M，Larlori C，Thomas A，et al．Peripheral cytokines profile in Parkinson＇s disease〔J〕．Brain Behav Immun，2009; 23(1): 55-63.

8王彥春，程宇核，馬駿，等.電針對帕金森病模型大鼠黑質TNF-α、IL-1β表達的影響〔J〕．世界針灸雜志，2011; 21(3): 46-9.

9 Fukunaga K，Miyamoto E. Role of MAP kinase in neurons〔J〕．Mol Neuro-biol，1998; 16(1): 79-95.

10 Zhu JH，Kulich SM，Oury TD，et al．Cytoplasmic aggregates of phosphorylated extracellular signal regulated protein kinases in Lewy body diseases〔J〕．Am J Pathol，2002; 161(6): 2087-98.

11韋強，郭強，王宏磊. ERK1/2在老年病治療中的研究進展〔J〕．中國老年學雜志，2012; 32(6): 1319-22.

12周丹，沈勤．ERK信號轉導通路在LPS誘導的炎癥過程中的表達〔A〕．華東六省一市生物化學與分子生物學會2008年學術交流會論文摘要匯編〔C〕，南通: 2008年．

13趙明，劉亞偉，劉愛華，等．細胞信號轉導分子在TNF-α誘導c-jun基因表達中的作用〔J〕．生物化學與生物物理學報，2000; 32(3): 59-65.

14姜勇，龔小衛. MAPK信號轉導通路對炎癥反應的調控〔J〕．生理學報，2000; 52(4): 267-71.

〔2014-05-22修回〕

(編輯袁左鳴)

Effect of electroacupuncture on ERK1/2 signaling pathway of substantia nigra cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease

WANG Shu-Ju，MA Jun，WANG Yan-Chun，et al．
College of Acupuncture＆Orthopedics，Hubei University of Chinese Medicine，Wuhan 430065，Hubei，China

【Abstract】Objective To observe the effect of electroacupuncture(EA)on ERK1/2 signaling pathway and inflammatory cytokines TNF-α in substantia nigra(SN)cells of rotenone-induced rats model with Parkinson＇s disease(PD)，and explore the mechanism of EA on PD．Methods A total of 32 male SD rats were randomly and averagely divided into normal，sham-operation，model and EA groups．Model and EA groups were injected intradermally with rotenone(dissolved in DMSO and saline in certain percentage)on the nape of the neck for 14 d to establish PD model rats．Behavioral assessment was conducted after the establishment of PD rats model．EA group was applied to "Fengfu" and "Taichong" points for 20 min once daily for 14 d．Other groups were not given treatments．After the treatments，the rats were killed for sampling substantia nigra tissue to detect the number of TH，p-ERK1/2 and TNF-α positive cells by inmmuno-histochemistry．Results Rats in each group performed differently in neurobehavior．Compared with normal and sham-operation groups，the expressions of TH positive cells were significantly reduced in model group(P＜0．05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly increased in model group(P＜0．05)．Compared with that of model group，the expression of TH positive cells was significantly increased in EA group(P＜0. 05)，the expressions of p-ERK1/2 and TNF-α positive cells were significantly reduced in EA group(P＜0．05)．Conclusions EA therapy might reduce the expression of TNF-α in SN of PD rats by regulating the expression of p-ERK1/2(MAPK pathway)，which might delay the process of PD．

【Key words】Parkinson＇s disease; Electroacupuncture; MAPK/ERK1/2; TNF-α; Tyrosine hydroxylase

通訊作者:馬駿(1964-)，女，教授，博士，主要從事針灸防治腦病及神經系統疾病的研究。

基金項目:國家自然科學基金項目(No．81273863);湖北省自然科學基金計劃項目(No．2013CFB066);湖北省教育廳科研項目(No．Q20121608);湖北省教育廳高等學校優秀中青年科技創新團隊計劃項目(No．T201308)

〔文章編號〕1005-9202(2015)20-5694-04;

doi:10. 3969/j. issn. 1005-9202. 2015. 20. 007

〔文獻標識碼〕A

〔中圖分類號〕R749

第一作者:王述菊(1977-)，女，副教授，博士，主要從事針灸防治腦病及神經系統疾病的研究。