瑪咖發酵酒工藝優化*

涂行浩，張弘，鄭華，張雯雯，宋國彬，徐涓

1(中國林業科學研究院資源昆蟲研究所，云南昆明，650224)

2(中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所，廣東湛江，524091)

近年來，瑪咖(Lepidium meyenii Walp.)作為現代保健品和天然藥物，受到越來越多的國際植物學專家和醫藥專家的關注［1-2］。以瑪咖塊根為主要原料生產的保健酒，可更充分地發揮其醇溶性功效成分［3-4］的作用，拓展瑪咖產品領域。目前，對瑪咖酒的研究傾向于采用2種方法，一是單獨浸泡［5］或將瑪咖與其他水果或中藥材(如葡萄、紅景天、枸杞等)配伍浸泡［6-8］，但這種浸泡不能高效提取瑪咖中多種營養和功效物質，且產品常有異味;二是將瑪咖同葡萄等高糖含量的水果一同發酵制酒［9-11］。本研究采用瑪咖單獨發酵制酒技術，以響應面法優化主要工藝條件，期望能充分保留其芥子油苷、生物堿等特殊功效成分，滿足人體的保健需求并具有果酒的口感，減少和消除異味，為瑪咖資源綜合利用和新產品的研發提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

自然干燥瑪咖塊根，由中國林業科學研究院資源昆蟲研究所滇中高原試驗站提供，用中藥粉碎機粉碎后過篩。主要成分含量(%):水分6.93、蛋白質10.16、總糖 39.98、淀粉 29.16、芥子油苷 1.56、生物堿0.38。

安琪牌活性釀酒酵母，安琪酵母股份有限公司;α-淀粉酶、糖化酶、鹽酸小檗堿，上海阿拉丁化學試劑有限公司;黑芥子硫苷酸鉀(純度≥99.0%)，Sigma公司;甲醇、乙醇、Na2HPO4、NaH2PO4、溴麝香草酚藍、CHCl3、無水CaCl2，國藥集團化學試劑有限公司(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

DYQ-401B參茸中藥切片機、中藥粉碎機，浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司;MM400型冷凍混合球磨儀，德國Retsch公司;AB204-S精密型電子天平、HR83-P型快速鹵素水分測定儀，Mettler Toledo中國有限公司;HH-6型數顯恒溫水浴鍋，常州澳華科技有限公司;Epsilon 1-4中試型凍干機，德國Christ公司;BCD-539WT冰箱，青島海爾股份有限公司;TY742X2A純水機，美國Barnstead公司;10～1 000 μL手動可調量程單道移液器，德國Eppendorf公司;EYELA.MTI-201溫度梯度恒溫箱，東京理化器械株式會社;Z323K通用型高速冷凍離心機，德國Hermie公司;DU800型紫外-可見光分光光度計，美國貝克曼庫爾特有限公司;Acme 6100 GC氣相色譜儀，韓國英麟機器株式會社。

1.3 實驗方法

1.3.1 瑪咖發酵酒生產工藝流程及操作要點

將瑪咖粉加入適量水攪拌混勻，置于實驗專用微波爐內進行預處理，600 W加熱1 min，取出冷卻，先加入α-淀粉酶液化，60℃、pH 6.0～6.5條件下液化24 h，再加入糖化酶糖化，60℃、pH 4.0～4.5條件下糖化24 h，最后加入活化的釀酒酵母、適量SO2、控溫發酵8 d。滅菌離心分離得到原酒，將酒液裝瓶后密封于70℃巴氏殺菌20 min，冷藏檢測。

1.3.2 發酵溫度的確定

在料液比1∶7、酵母添加量0.6%、發酵至 pH 4.5時，根據預試驗結果，選擇發酵溫度20、25、30、35、40℃分別控溫發酵，測定乙醇產量、芥子油苷浸出率，根據試驗結果選擇合適的發酵溫度進行工藝優化。

1.3.3 料液比的確定

分別選擇料液比 1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9。對 5 g原料，先后在糊化、液化、糖化和酵母菌接種階段分別加入水(其中糊化階段加10 mL)?？販匕l酵，測定酒精產量、芥子油苷浸出率，根據試驗結果選擇合適的料液比進行工藝優化。

1.3.4 酵母接種量確定

在料液比1∶7、發酵 pH 4.5、溫度25℃時，選擇0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%酵母添加量，控溫發酵，測定乙醇產量、芥子油苷浸出率，從而選擇合適的酵母添加量進行工藝優化。

1.3.5 分析測定方法

乙醇含量、總芥子油苷、總生物堿、殘糖測定分別采用氣相色譜法法［12］、氯化鈀法［4］、酸性染料比色法［1］、折光糖度計直接測定法測定。乙醇產量以每100 g干瑪咖粉發酵產乙醇體積表示。芥子油苷以及總生物堿浸出率分別采用式(1)和(2)計算:

式中，y1為芥子油苷浸出率;m1為瑪咖發酵酒中芥子油苷含量;m2為瑪咖粉中芥子油苷含量;y2為總生物堿浸出率;m3為瑪咖發酵酒中總生物堿苷含量;m4為瑪咖粉中總生物堿含量。

殘余 SO2總量的測定按《GB/T5009.49—2008發酵酒及其配制酒衛生標準的分析方法》［13］測定。重金屬、有害微生物的檢測按《GB2758—2005發酵酒衛生標準》［14］測定。酒中游離氨基酸成分分析:取10 mL酒樣，加10 mL 8%磺基水楊酸溶液，并加0.1 g活性炭進行脫色處理，充分搖勻，于4℃冰箱內靜置2 h，以8 000 r/min 離心 15 min，用 0.45 μm 微孔膜過濾。取透明濾液1.0 mL，用0.1 mol/L HCl稀釋至25 mL，用氨基酸分析儀分析測定［15］?，斂Оl酵酒感官檢測按《GB15037—2006 葡萄酒》［16］檢測。

2 結果討論

2.1 各單因素處理對乙醇及芥子油苷含量的影響

2.1.1 發酵溫度對瑪咖發酵酒中乙醇和芥子油苷含量的影響

果酒酵母生長繁殖的適宜溫度為22～25℃，一般來說，酵母生長及發酵的速度隨溫度升高而加快，溫度較高時，發酵劇烈、起酵快，但酵母衰老快，反而導致生成酒精質量分數低，揮發性香氣成分損失較多，且腐敗微生物易在高溫條件下生長發育，使果酒質量下降。此外，果酒酵母不耐高溫，沒有乙醇時，溫度超過35℃會影響酵母繁殖，在40～45℃條件下1 h即可致死，而在含有10%乙醇的條件下，致死溫度僅為30℃［17］。如圖1所示，瑪咖發酵酒乙醇產量，隨發酵溫度的升高呈現先增加后降低的趨勢，25℃時達到最高;由圖1中芥子油苷含量的變化趨勢可見，25℃時乙醇產量也達到最大值，且此時芥子油苷浸出率也較高。溫度繼續升高，芥子油苷浸出率上升趨勢不明顯，故選擇發酵溫度25℃為中心點，20～30℃區間進行優化較為合適。

圖1 發酵溫度對乙醇產量及芥子油苷浸出率的影響Fig.1 The effect of the temperature on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.1.2 料液比對乙醇和芥子油苷含量的影響

料液比對乙醇和芥子油苷含量的影響如圖2所示?，斂Оl酵酒乙醇產量隨料液比的增加而增加，但超過1∶7后，乙醇產量增加趨勢不明顯，料液比的增加稀釋了溶液濃度，從而導致體積分數下降較明顯。芥子油苷既是醇溶性物質，也是水溶性物質，料液比增加在總體上有利于芥子油苷的溶出。由圖2可知，隨著料液比的增加，芥子油苷浸出率一直呈上升趨勢，料液比為1∶7時，芥子油苷浸出率能達到57.1%。在乙醇產量較高的情況下，兼顧考慮芥子油苷浸出率與瑪咖發酵酒的乙醇體積分數，綜合選擇料液比為1∶7為中心點，在料液比1∶5 ～1∶9進行優化較為合適。

圖2 料水比對乙醇產量、芥子油苷浸出率以及乙醇體積分數的影響Fig.2 The effect of the content of yeast on ethanol volume fraction and glucosinolates

2.1.3 酵母添加量對乙醇和芥子油苷含量的影響

由圖3可知，乙醇體積分數隨酵母添加量的增加而增加，當酵母添加量增加到0.8%以后，乙醇體積分數的增加趨于平緩。這是因為酵母能使糖完全發酵，酵母添加量增加則糖的發酵量也相應增加。但由于含糖量有限，當完全發酵后，繼續增加酵母添加量，乙醇含量也不再增加。由圖3中芥子油苷含量變化趨勢可見，酵母添加量為0.8%時乙醇含量達最大，而此時芥子油苷含量也處于較高水平，綜合乙醇含量及芥子油苷含量，選擇酵母添加量0.8%為中心點，在0.4%～1.2%進行優化最佳。

圖3 酵母添加量對乙醇體積分數及芥子油苷浸出率的影響Fig.2 The effect of the content of yeast on alcohol production and leaching rate of glucosinolates

2.2 瑪咖發酵酒工藝參數的響應面優化

2.2.1 瑪咖發酵酒條件優化

在單因素試驗基礎上，利用Design-expert 7.1.3軟件，采用中心組合試驗設計，以影響瑪咖發酵酒的3個主要因素發酵溫度、料液比和酵母添加量為響應變量(分別用A、B和C來表示)，乙醇產量及芥子油苷浸出率為響應值進行響應面優化，試驗因素水平設計見表 1［18］。

表1 響應面分析因素與水平表Table 1 Factors and levels for RSM

2.2.2 工藝模型建立及其顯著性檢驗

結合單因素實驗結果，利用Design-Expert軟件，按CCD中心組合實驗設計原理進行3因素3水平實驗，以乙醇產量和芥子油苷浸出率為響應值，通過響應曲面法進行優化，以期望得到瑪咖發酵酒最佳工藝條件。實驗設計如表2所示。

表2 中心組合設計實驗結果Table 2 Central composite design matrix and experimental results

將所得的試驗數據用Design Expert軟件進行多元回歸擬合，得到以瑪咖發酵酒乙醇產量及芥子油苷含量為目標函數的二次多項回歸方程，結果見表3。由表3可知，得到的2個數學擬合模型Y1和Y2的R2值分別為0.984 3和0.932 2，其值均接近1，表明模型與試驗擬合度較好，結果具有較高的可靠性，可用于分析和預測瑪咖發酵酒工藝中乙醇產量和芥子油苷浸出率。

為檢驗方程的有效性，對上述回歸模型進行方差分析(表4)。從表4回歸方程系數檢驗可以看出，各發酵因素的改變對2個響應值的影響不是簡單的線性關系，而是各因素存在交互作用的影響，如乙醇產量模型的一次項B、C極顯著，而A顯著;交互項AB、AC顯著，BC不顯著;二次項A2、C2極顯著，B2顯著。芥子油苷模型的一次項 A、B、C均極顯著;交互項AB、AC 顯著，BC 不顯著;二次項 B2、C2極顯著，A2顯著。結合F值的大小，可知影響瑪咖發酵酒乙醇產量主效應關系為酵母添加量＞料液比＞發酵溫度;影響芥子油苷浸出率的主效應關系為料液比＞發酵溫度＞酵母添加量。

表3 瑪咖酒乙醇及芥子油苷含量回歸模型擬合結果Table 3 Variance analysis for the fitted regression model

表4 瑪咖酒乙醇及芥子油苷含量方差分析結果Table 4 Significance test for regression coefficients of the fitted regression model

2.2.3 響應面分析及最優條件的確定

根據回歸方程作出模型的響應曲面及等高線見圖4。圖4較直觀地反映了任何兩因素的交互影響，以及各因素對2個響應值的影響。本實驗主要以酒精產量和功效成分芥子油苷浸出率為響應指標，討論瑪咖發酵酒的最佳制備工藝條件，利用Design-expert7.1.3軟件對試驗結果進行優化，得到最佳工藝條件并在圓整條件下進行驗證。

由圖4結果可知，發酵溫度、料液比以及酵母添加量均對瑪咖發酵酒酒精產量和芥子油苷浸出率有較大程度的影響，且各因素之間有非常明顯的交互作用。由于本實驗主要關注瑪咖粉中的淀粉和糖質成分是否發酵完全并得到有較高乙醇體積分數和富含芥子油苷成分的保健酒，因此選擇乙醇產量重要性為5，芥子油苷浸出率重要性3，乙醇產量目標值為31.58～500的最大值響應，芥子油苷浸出率目標值為46.9～100的最大值響應，預測得到較佳的發酵工藝條件為:發酵溫度25.13℃，料液比7.96，酵母添加量9.5 g/L，在此條件下響應面模型預測的瑪咖發酵酒乙醇產量為40.97 mL/100 g，芥子油苷浸出率為57.69%。

圖4 各因素對乙醇產量及芥子油苷浸出率影響的響應曲面圖Fig.4 Response surface plot and its contour plot showing the effect of three factors on alcohol production and leaching rate of glucosinolate

2.3 驗證試驗

根據模型預測值，圓整發酵工藝條件為:發酵溫度25.0℃，料液比8.0，酵母添加量9.5 g/L，在該條件下進行3次平行確證試驗，取平均值。實際測得的瑪咖發酵酒酒精產量為41.16 mL/100g，與預測值相差0.19 mL/100g，芥子油苷浸出率為57.53%，與預測值相差0.16%，實際值與預測值均相差不大，說明該方程與實際情況擬合良好，證明用響應曲面法預測瑪咖發酵酒工藝條件是可行的。

2.4 常規指標檢測

經檢測，由優化工藝條件制得的瑪咖發酵酒中，芥子油苷含量為0.827 g/L，浸出率為57.53%，生物堿含量為0.192 g/L，浸出率為42.71%，固形物質量分數為4.065 g/L，總酸質量分數為2.6 g/L，總酯質量分數為0.146 1 g/L，干浸出物為20.56 g/L，衛生指標中游離SO2未檢出，重金屬鉛、汞未檢出，腸道致病菌金黃色葡萄球菌、沙門氏菌等未檢出。其中固形物質量分數偏高可能是由于瑪咖發酵酒中其他物質溶出，改變了酒的風味，同時使酒樣中固形物質量分數增高?，斂Оl酵酒中氨基酸種類齊全，共檢測出17種氨基酸(色氨酸未檢測)，氨基酸總量達到862.01 mg/100 mL，其中脯氨酸的含量非常高，達到602.52 mg/100 mL。一般在逆境條件下(旱、鹽堿、熱、冷、凍)，植物體內脯氨酸的含量會顯著增加，在一定程度上反映了植物的抗逆性，可作為植物抗寒育種的生理指標［18］，這與瑪咖一般在高寒山區種植的情況吻合。另外，由于脯氨酸親水性極強，也可能導致其在瑪咖發酵過程中大量溶入發酵酒內。除脯氨酸以外，其他氨基酸的組成合理，其中必需氨基酸的含量達到61.27 mg/100 mL，具有抗中樞疲勞作用的3種氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸)含量高達37.89 mg/100 mL。

2.5 感官指標

色澤:呈棕紅色，清亮透明;香氣:有瑪咖的特殊風味，略帶醇香，無異味，余味悠長;口感:入口平順，略帶酸澀;風格:具瑪咖發酵酒獨特風格。

3 結論

發酵前處理:發酵前對瑪咖粉微波處理后，表面較疏松，細胞破碎程度較大，以糊化態存在。有利于淀粉、生物堿、芥子油苷、糖類等細胞內物質溶出，且采用微波技術對瑪咖進行處理較蒸煮處理時間短，操作簡單，可有效減少水分蒸發和功效成分損失，適用于瑪咖發酵前處理工藝。

瑪咖發酵酒最佳發酵工藝條件為:發酵溫度25℃、料液比1∶8(g∶mL)、酵母接種量0.95%。該條件下所得瑪咖酒的乙醇產量為41.16 mL/100 g，芥子油苷浸出率57.53%、生物堿浸出率42.71%。產品顏色棕紅，清亮透明，酒體協調，略帶醇香，具瑪咖特殊氣味，氨基酸組成合理，主要衛生指標合格，順應了現代人提倡適量飲用低度營養發酵酒的健康理念。

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