7個短枝木麻黃種源耐寒評價及綜合分析

劉 芬，姜清彬，馬英姿，仲崇祿，張 勇，陳 羽，陳 珍

（1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.中國林科院熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520）

7個短枝木麻黃種源耐寒評價及綜合分析

劉 芬1,2，姜清彬2，馬英姿1，仲崇祿2，張 勇2，陳 羽2，陳 珍2

（1.中南林業科技大學，湖南 長沙 410004；2.中國林科院熱帶林業研究所，廣東 廣州 510520）

對7個短枝木麻黃種源的離體小枝在人工氣候箱中進行梯度低溫處理, 在25 ℃，5 ℃，0 ℃，-5 ℃ 和-10 ℃溫度下處理24 h，重復3次，每個種源的每個處理采集10株苗的枝條，測定了滲透率、丙二醛含量、脯氨酸含量、可溶性蛋白含量，可溶性糖含量等9個耐寒指標。通過半致死溫度評價了7個種源的耐寒能力，并通過耐寒指標的特征結合相關分析對耐寒指標進行篩選。運用主成分分析、回歸分析和聚類分析對耐寒指標進一步綜合分析。結果表明：利用短枝木麻黃的半致死溫度對7個種源進行排序，耐寒能力按種源號依次為18402＞18268＞18119＞18267＞18128＞18015＞18244。用逐步回歸的方式建立短枝木麻黃的耐寒回歸方程為Y=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2，(R2=1.000)，估計精度大于98%。

短枝木麻黃；種源耐寒評價；低溫脅迫；主成分分析；線性回歸

短枝木麻黃Casuarina equisetifolia耐鹽堿、抗風害、沙埋能力強，樹干較通直，主根深長，有根瘤菌固氮，適應性強，能在濱海有機質低的沙土上迅速生長[1]，是我國華南沿海防護林的重要樹種，也是防風固沙農田防護林的先鋒樹種之一[2]。但是由于短枝木麻黃不耐寒，嚴重限制了其栽種范圍，且近年來的極端氣溫頻繁出現，對耐寒的短枝木麻黃的選育得尤為重要。木麻黃的耐寒研究，主要集中在耐寒性比較及對耐寒獨立指標的分析[3-5]，未對耐寒指標進行綜合評價。本文通過結合主成分分析、線性回歸分析、及聚類分析，旨在建立短枝木麻黃在寒冷脅迫下的耐寒評價模型。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的7個種源的短枝木麻黃種子由澳大利亞林木種子中心（CSIRO）提供，種源信息見表1。2012年4月播種，6月移栽于試驗地苗圃。試驗地設在廣州市中國林業科學研究院熱帶林業研究所苗圃，位于東經113°15′，北緯23°6′，海拔43 m。屬于南亞熱帶季風氣候，熱量充足，年平均氣溫22℃，極端最高溫39.3℃，極端最低溫0℃。雨量充沛，年均降雨量1 800 mm，主要集中在4～9月，年平均相對濕度74%。

表1 7個參試種源的種源信息Table 1 Information of 7 experimental provenances

1.2 方法

1.2.1 低溫處理

人工氣候箱中，采用雙因素隨機區組設計，參試種源7個，苗齡為2a，以每種源隨機選取10株苗的30個離體小枝條作為生理指標測試材料，采用25 ℃，5 ℃，0 ℃，-5 ℃，-10 ℃五個溫度梯度處理24 h，其中25℃為對照溫度組，每個溫度處理重復3次，合計處理苗木數為1 050株，即7種源×5溫度處理×10株×3重復。

1.2.2 生理指標測定

小枝的電解質滲透率（REC）采用電導率法[6:203-204]；丙二醛含量（MDA）用硫代巴比妥酸法[7]；蒽酮比色法[8:144-148]測定可溶性糖含量（SS）；磺基水楊酸法[8:228-231]測定脯氨酸含量(Pro)；考馬斯亮藍G-250法[8:142-143]測定可溶性蛋白(SP)；超氧化物歧化酶活性（SOD）采用NBT光化還原法[6:191-193]，葉綠素a含量（Chla）、葉綠素b含量(Chlb)、總葉綠素含量(Chl)采用丙酮-乙醇混合液浸提比色法[8:74-77]。

1.2.3 數據統計與分析

數據整理與分析采用Microsoft Excel 2010，用皮爾遜積差進行相關分析，用SPSS 19.0對數據進行主成分分析、回歸分析和聚類分析。以處理溫度和電解質滲透率擬合Logistic曲線計算半致死溫度LT50，具體計算方法參考時朝等[9]的方法。

除電解質滲透率外的8個耐寒指標，為消除不同量綱數據處理帶來的影響，通過公式計算成耐寒系數[10]：各指標耐寒系數（α）=處理測定值/對照測定值

2 結果與分析

2.1 寒冷脅迫對抗寒生理指標的影響及耐寒指標篩選

2.1.1 寒冷脅迫對細胞膜系統指標的影響

由表2可知，小枝的電解質相對滲透率均隨著溫度的降低逐漸上升，在5 ℃，0 ℃滲透率變化幅度小，說明該溫度對細胞膜的破壞性不大，繼續降溫到在-5 ℃，-10 ℃處相對電導率大幅度，膜透性增加，細胞膜遭到破壞。

植物在遭受傷害時與膜脂的過氧化作用密切相關，MDA反映植物在遭受傷害的過程中膜過脂氧化物的程度?？傮w的MDA含量均是處理組大于對照組，但在5 ℃～0 ℃過程中有兩個種源的MDA 含量低于對照組，該溫度處的MDA含量可能與耐寒性相關，記為MDA1。在5個處理溫度處理下，MDA 的含量總體的趨勢呈M型或N型（表2），說明在5 ℃附近植物有一個明顯的自我修復的過程，但在-5 ℃～10 ℃處，MDA的變化趨勢不一，記為MDA2。

2.1.2 寒冷脅迫對滲透性調節物質的影響

游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖，是植物細胞中重要的滲透物質。在低溫鍛煉過程中，可溶性蛋白含量、可溶性糖和游離脯氨酸都呈現出兩種變化，一種為逐漸上升，可能是在溫度降低以后，可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸含量的增加，可以有效提高細胞內的束縛水的能力，降低細胞的冰點，說明這些種源的抗性仍有繼續擴大的可能性[11]。另一種為先升后降，可能是過低的溫度使得植物細胞的機體運行能力下降，滲透調節物質開始降解[12:16-19]。不同種源的細胞滲透調節能力體現植物的耐寒能力。對照～5 ℃和0 ℃～-5 ℃的可溶性蛋白呈顯著正相關（表3），分別記為SP1和SP2。-5 ℃～-10 ℃的可溶性糖變化趨勢不一，記為SS1。

表2 不同溫度處理對參試種源生理指標的影響?Table 2 Effects of different concentrations frost stress on physiological indicators of tested provenances

表3 LT50與不同溫度下耐寒指標的相關分析?Table 3 Correlation analyze between LT50 and cold tolerance index at different temperature

2.1.3 寒冷脅迫對保護性酶和光合物質的影響

在植物體遭受寒冷脅迫時，植物體內的自由基增加，SOD是植物體內清除自由基的重要酶之一，在本實驗中，SOD出現反復的波動，體現了SOD在植物體內保持修復平衡。在對照～5 ℃和-5 ℃到-10 ℃處的變化趨勢出現分歧，分別記為SOD1，SOD2。

類囊體膜的組分、透性和流動性、及其葉綠素會響應植物體的低溫脅迫[13]。隨著溫度的降低，7個種源的短枝木麻黃的總葉綠素含量，葉綠素a/b含量都呈現先增加后減少或是平穩的趨勢，這與柏科的結果一致[12:19-20]，隨著溫度的降低，細胞開始脫水，而葉綠體還保持其光合的能力，因此葉綠素的相對含量升高。溫度繼續降低，葉綠體的結構遭到破壞，葉綠素的活性受到抑制甚至葉綠素本身開始降解，使得葉綠素含量降低，這與木麻黃在低溫下的枝條變紅褐色的形態結果一致。葉綠素a的變化趨勢呈現出兩個大的方向，可能與耐寒性相關，4個溫度區間的葉綠素含量分別記為 Chl1，Chl2，Chl3和Chl4；葉綠素 b的含量在5 ℃～-0 ℃和0 ℃～-5 ℃出現三個明顯不同的變化趨勢，分別記為Chlb1和Chlb2。在0～-5℃區間的總葉綠素記為Chl1。

2.1.4 半致死溫度LT50的確定

LT50能有效的反映植物的耐寒性能，通過相對滲透率擬合Logistic曲線[14]求出各種源半致死溫度LT50。半致死溫度均在-5℃附近，依據半致死溫度對短枝木麻黃耐寒性進行排序依次為18402（-5.956 ℃）＞ 18268（-5.930 ℃）＞ 18119（-5.494℃）＞ 18267（-5.220℃） ＞ 18128（-4.940℃） ＞18015（-3.669℃）＞18244（-3.475℃）。

2.2 短枝木麻黃抗寒性綜合評價體系的建立

根據上述上生理指標的分析，篩選出的15個與短枝木麻黃抗寒性密切相關的單項生理指標。即 LT50，MDA1，MDA2，SP1，SP2，SS1，SOD1，SOD2，Chla1，Chla2，Chla3，Chla4，Chlb1，Chlb2，Chl1。

2.2.1 主成分分析

以15個單項指標為變量進行主成分分析，累計貢獻率達到96.314%，說明該15個指標已經包含了短枝木麻黃耐寒的大部分信息。主成分1包含的信息主要為葉綠素a，保護酶和可溶性蛋白。主成分2主要攜帶膜系統和SS1的信息。主成分3攜帶葉綠素b和SP的信息，主成分4攜帶的信息為總葉綠素，最后一個主成分攜帶SOD的信息。從各種源在各主成分的得分情況看，在各種源的得分最高的主成分不盡相同，在4個主成分中都有分布。因此難以通過種源在主成分的得分情況揭示短枝木麻黃耐寒的特性。還需借助回歸進一步分析。

表4 短枝木麻黃耐寒綜合評價主成分分析Table 4 Principal component evaluation based on cold tolerance of C. equisetifolia

表5 參試種源主成分得分Table 5 Principal component factor scores of tested provenances

2.2.2 回歸分析

以LT50為因變量，剩下的14個指標作為自變量，以回歸方程中F檢驗的相伴概率值小于0.05的選入方程，大于0.1的移出方程進行逐步回歸分 析。14個 指 標 中 Chla2，Chla3，Chla4，SP1，MDA1被引入方程，回歸方程為：

從回歸方程可以看出短枝木麻黃的耐寒性主要與葉綠素a在-5 ℃～-10 ℃的變化呈負相關，也與葉綠素a在0 ℃～5 ℃呈一定的正相關。將數據代入方程對方程精度進行評價，由表6 可知方程的估計精度均在98%以上，說明該方程符合對短枝木麻黃耐寒性評價的要求。

表6 回歸方程的估計精度分析Table 6 Estimated accuracy analysis of regression equation

2.2.3 聚類分析

通過回歸得出影響短枝木麻黃耐寒性的5個指標，以LT50和5個指標的耐寒系數進行聚類分析（表7），第一類中，半致死溫度低，光合物質的平均值在4個類別中都是最大值。第二類中，半致死溫度較低，光合物質的平均值都處于中等水平，但可溶性蛋白在對照～5 ℃處處于4類中的最高水平。第三類的半致死溫度明顯低于第二類，Chla4在4類中最低，且MDA的含量在5 ℃～0 ℃溫度變化過程中偏高SP1也比第二類低很多。第四類半致死溫度最高，最不耐寒，光合物質相比前三大類別都偏低。

表7 聚類分析結果Table 7 Results of cluster analysis

3 結論與討論

寒冷脅迫是植物重要的環境脅迫之一，植物的抗寒性與自然對植物的選擇和植物對自然的適應過程中，微效并特異的抗寒基因進調控有關。低溫半致死溫度是植物在遭受寒冷脅迫后能否恢復生長的一個臨界值，能較準確反映植物的抗寒能力[15-17]。本試驗通過短枝木麻黃小枝在低溫脅迫下的滲透率擬合Logistic曲線得出半致死溫度，根據半致死溫度對7個種源的耐寒順序排序，各種源號的耐寒力從大到小依次為18402＞18268＞18119＞18267＞18128＞18015＞18244。

主成分分析可以簡化數據集，保持對方差貢獻大的數據。本文通過單項指標分析結合相關分析對耐寒指標進行簡化選出與耐寒性密切相關的15個指標。通過主成分分析，15個指標的貢獻率達到96.341%，說明該15個指標包含短枝木麻黃耐寒的大部分信息。通過線性回歸對指標進一步篩選，并得出回歸方程LT50=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2，通過半致死溫度的精度分析和聚類分析進行驗證。

在植物中，耐寒能力強的植物保持光合作用的能力要比耐寒性差的強[18-19]。植物在低溫逆境下葉綠素降低，光和機能的破壞導致植物死亡[20-21]。在本文中葉綠素a的含量在回歸方程中占三個指標，體現了其對短枝木麻黃耐寒性的影響的重要性。經過聚類分析也表明，葉綠素a的含量是影響聚類結果的重要的指標。

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Evaluation and Comprehensive Analysis of Cold Tolerance on SevenCasuarina equisetifoliaProvenances

LIU Fen1,2, JIANG Qin-bin2, MA Ying-zi1, ZHONG Chong-lu2, ZHANG Yong2, CHEN Yu2, CHEN Zhen2
(1.Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, Hunan, China; 2. Research Institute of Tropical Forestry,CAF, Guangzhou 510520, Guangdong, China)

The 9 physiological traits were measured with seedlings of sevenCasuarina equisetifoliaprovenances, which treated under fi ve low temperature gradients (25℃ , 5℃ , 0℃ , -5℃ and -10℃ ) for 24 hours, the test was repeated 3 times. Ten seedlings’ branches on per treatment per provenance were collected, and theirs nine cold resistance indexes such as permeability, MDA, proline content,soluble protein content, soluble sugar content, etc. were determined in artif i cial climate chamber. The cold resistance capability were evaluated by semilethal temperature(LT50). Combined correlation analysis and characteristics analysis, the cold-resistant indexes were screened. Principal component, regression and cluster analysis were used for further comprehensive analysis on the selected coldresistant indexes. The results show that sevenC. equisetifoliaprovenances were sequenced in freeze resistance capability according to their semi-lethal temperature from big to small as follows: 18402＞ 18268＞ 18119＞ 18267＞ 18128 ＞ 18015 ＞ 18244; The regression equation was built by stepwise regression method: LT50=9.462-0.119Chl4-0.026SP1-0.039MDA1+0.051Chla3-0.008Chla2,(R2=1.000), the estimation accuracy of the model was higher than 98%.

Casuarina equisetifolia; provenance cold tolerance evaluation; low temperature stress; principal component analysis; linear regression

S718.43；S792.93

A

1673-923X(2015)06-0040-05

10.14067/j.cnki.1673-923x.2015.06.008

2014-11-05

十二五科技支撐計劃任務（2012BAD01B0603）；廣東省林業科技創新招標項目（201401）；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項基金（RITFYWZX201203）

劉 芬，碩士研究生 通訊作者：馬英姿，博士，教授

劉 芬，姜清彬，馬英姿，等. 7個短枝木麻黃種源耐寒評價及綜合分析[J].中南林業科技大學學報,2015,35(6):40-44,62.

[本文編校：吳 彬]